血清孕酮是临床检验的重要项目之一，主要用于黄体功能判断和异常妊娠的诊断，对相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。临床上血清孕酮的常规测定方法主要为各种免疫分析方法，由于校准和方法特异性等原因，其测定结果间往往缺乏可比性，因此实现血清孕酮标准化迫切需要建立准确、精密的参考方法。本研究对血清孕酮测定的样品前处理、衍生化反应、色谱质谱条件、定量方法等过程进行了详细的研究，在国内首次使用同位素稀释／气相色谱／质谱（ID-GC／MS）技术建立了血清孕酮准确测定方法。方法以[3，4-¹³C₂]孕酮为内标，经正己烷提取血清后，以羟丙基-β-环糊精水溶液净化，用七氟丁酸酐将孕酮衍生为孕甾-3，5-二烯-20-酮-3-七氟丁酸酯，使用气相色谱质谱联用系统选择离子监测模式检测孕酮与内标的特定碎片离子，用包括法定量。经方法学考察，本研究建立的血清孕酮测定方法的总变异系数为0.69％～2.12％，平均分析回收率为98.3％～100.1％，分析的检测限为1.5pg（孕酮绝对量）。分析欧盟标准物质与测量研究所（IRMM）的血清孕酮标准物质ERM-DA347，测定结果与靶值的偏差小于1.5％。利用本法参加2006年国际计量局物质量咨询委员会（CCQM）组织血清孕酮的国际比对CCQM-P77b，测定结果与其他各国达到等效一致。方法精密、准确，具有良好的特异性和灵敏度，可望用作为血清孕酮测定参考方法。