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瓜类细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch, BFB)是由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的种传性病害,主要为害葫芦科作物。西瓜噬酸菌主要侵染寄主叶片和果实,发病严重时引起果实腐烂和种子带菌,严重威胁西甜瓜产业的健康发展。 病原菌的粘附能力与其致病力密切相关,而鞭毛和趋化性均被认为与病原菌在寄主表面的粘附能力密切相关。为研究鞭毛素基因和趋化性核心基因同时缺失对西瓜噬酸菌Aac-5的影响,本研究成功构建了鞭毛素基因fliC和趋化性核心基因cheA双基因缺失突变菌株△cheA△ fliC及其互补菌株,鞭毛素基因缺失突变株△fliC及其互补菌株△fliC∷fliC作为对照;为研究鞭毛缺失对西瓜噬酸菌Aac-5的影响,成功构建了鞭毛合成调控基因fliA缺失突变株△fliA及其互补菌株△fliA∷fliA;对以上突变株及互补菌株进行了致病力与生物学特性测定,并经实时荧光定量PCR测定△cheA△fliC、△fliC和△fliA中Ⅲ型分泌系统、毒性蛋白、群体感应等相关基因的表达情况。 结果如下: (1)西瓜噬酸菌fliA、fliC生物信息学分析 生物信息学分析发现,fliA调控细菌鞭毛的合成,fliC编码鞭毛素蛋白;西瓜噬酸菌中FliA蛋白与洋葱酸皮病菌(Burkholderia cenocepacia)的FliA蛋白亲缘关系最近;西瓜噬酸菌中FliC蛋白与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)的FliC蛋白亲缘关系最近。 (2)西瓜噬酸菌△fliA突变菌株及△fliA∷fliA互补菌株生物学特性测定 △fliA与野生型Aac-5相比,鞭毛缺失、运动能力、致病力等均显著下降、生物膜形成能力显著增强,互补菌株△fliA∷fliA基本能够恢复这些能力。 (3)△cheA△ fliC、△fliC及相应互补菌株生物学特性测定 △ cheA△fliC与野生型Aac-5相比,致病力、运动能力、生长能力均显著下降,生物膜形成能力显著增强、种子粘附能力显著降低,互补菌株△cheA△ fliC∷cheA∷fliC基本能够恢复这些能力;与△fliC和△cheA单缺失突变株相比,△cheA△fliC致病力显著下降,生物膜形成能力显著提升,说明鞭毛素基因和趋化性核心基因同时缺失对西瓜噬酸菌致病力和生物膜形成能力影响更为显著;三者运动能力基本保持一致,说明fliC缺失与cheA缺失同样影响西瓜噬酸菌的运动能力。西瓜噬酸菌Ⅱ组菌株鞭毛素fliC突变菌株△fliC与Ⅰ组菌株M6鞭毛缺失突变株的的致病力及运动性变化趋势一致。 (4)西瓜噬酸菌fliA、fliC缺失突变菌株中相关基因表达量的影响 △fliA突变菌株中hrpA、hrcU、 trbC、virB、luxI、 luxR、ropN基因表达量均极显著降低,表明hrpA、hrcU、 trbC、virB、luxI、 luxR、ropN基因受fliA正调控。△cheA△fliC突变菌株中Ⅲ型分泌系统相关基因hrcU、 hrpA、hrpE,毒性蛋白相关基因trbC,鞭毛相关基因fliM表达量均下调,这与△fliC和△cheA单缺失突变株中这些基因表达量变化趋势一致,该现象解释了致病力及相关表型变化,同时证明了趋化性核心基因cheA对鞭毛基因fliM有调控作用。