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1研究背景早在1893年,Neuber就开始通过实施自体脂肪移植治疗患有组织缺损的患者,为临床中治疗组织萎缩缺损提供了新的思路。20世纪80年代脂肪抽吸技术出现之后,脂肪抽吸术联合自体脂肪移植尤以其容易大量获取填充组织、不影响供区功能、自体移植后无免疫排斥反应等优点成为治疗软组织缺损理论上的首选方法并越来越受到学者们的青睐。但是通过大量临床实践及实验研究表明,在自体脂肪颗粒注射填充移植后,移植的脂肪组织在早期处于缺血缺氧的微环境状态,无法建立起有效的血液循环,仅仅依靠受区组织液渗透获取营养,术后数天受区才有新生血管长入并建立血液循环,从而导致了一定比例的脂肪组织由于缺氧而无菌性坏死。于是在进一步证实了该项技术的安全性和可靠性的同时一些学者又提出了许多降低脂肪吸收率以提高手术效果的方法:例如混入促进细胞存活的因子、改良脂肪提取及注射方法等,但效果总体来说不够理想。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是指一类来源于发育早期的中胚层和外胚层的多能干细胞,与胚胎干细胞相比,虽然其分化能力相对受限,但这也正保证了间充质干细胞移植的安全性。正是由于具有获取源较广、较强的分化能力、低成瘤性并且可自体移植避免免疫排斥反应等生物学特性,近年来间充质干细胞广泛应用于各种细胞和基因水平的治疗。从2001年zuk等人通过脂肪抽吸术获得了脂肪来源的多能干细胞起,脂肪来源间充质干细胞(Adipose-derived stem cells, ASCs)作为一种相比于其他来源间充质干细胞具有一次获取量大、配合自体移植方便等优点,从而越来越多的被用于组织工程或细胞治疗。例如在组织工程方面,脂肪来源间充质干细胞广泛被作为成脂、成骨等的再生种子细胞来源。目前,国内外一些学者已经提出,事先抽取患者的少量脂肪用于提取ASCs并进行体外扩增培养,然后再次结合利用在脂肪移植术中。报道中称利用该方法能显著的提高脂肪存活率,减少术后补充注射的次数。一般认为在该结合了ASCs的脂肪移植术中,ASCs主要起着以下作用:1.分泌多种细胞因子(VEGF-A, FGF-2,HGF,IL-1,TGF-P等);2.迁移至创伤处增值并分化为功能细胞;3.起着免疫调节的作用;4.激活内在细胞活性。但是一旦ASCs进入移植体内后,进行下一步的调控会非常困难。所以这就需要我们在将细胞移植体内前先进行适当的预调控。目前我们提取ASCs后通常是在体外培养于常氧浓度(21%02),但是在该氧气浓度与细胞移植到体内后所面对的缺氧环境下的氧气浓度有着较大的差别。所以如果我们在体外常氧下进行关于ASCs的实验和研究并不能客观地体现出细胞在体内移植后由于相对的缺氧缺血微环境而导致的增值及转归等能力的变化。缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)于1992年被Semenza和Wang首先发现,它普遍存在于人和哺乳动物细胞内,通常虽然在常氧下(21%O2)细胞也会有表达,但合成的HIF-1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解,只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达。HIF-1在调控细胞面对缺氧环境时的增值、迁移、分化等能力发挥关键的作用,现在许多研究表明,肿瘤周围的缺氧环境导致的肿瘤细胞HIF-1上调是在肿瘤的发展、转移的关键因素。有一些学者发现,HIF-1同样能对干细胞的迁移、分化等产生作用,而且在将骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)用于移植治疗之前经过适量的缺氧预处理会得到更好临床效果,认为这是由于细胞处于缺氧微环境时会上调的基质细胞衍生因子1(SDF-1)的受体CXCR4的表达,而SDF-1作为一种常见的趋化因子会在损伤的组织中较高表达。他们认为正是这存在了这样的关系而导致了经过缺氧预处理的干细胞能够更加精确的达到创伤组织处参与创伤组织的修复。氯化钴(CoCl2)可以抑制脯氨酸羟化酶(Prolyl hydroxylases, PHD)的活性,从而抑制HIF-1α的羟化,减少常氧状态下HIF-1α的降解,所以近年来CoCl2被视作是一种成熟的缺氧模拟剂。相对于昂贵的三气培养箱,氯化钴制造缺氧环境的成本更低及缺氧程度可控性更佳,更加适合用于大规模的模拟细胞缺氧。本研究的目的就是首先在体外让ASCs处于不同的CoCl2的浓度下培养,检测ASCs在不同环境培养时HIF-1α的表达。验证了调节CoCl2的浓度建立梯度缺氧模型的可行性,并且通过一系列进一步实验验证脂肪干细胞在处于CoCl2培养环境下时所表达的增殖能力、分化趋势、迁移能力的变化,探讨CoCl2对ASCs进行预缺氧来提高脂肪移植术的疗效的可能性。2实验方法2.1大鼠ASCs的获取:采用细胞贴壁法分离培养ASCs,倒置显微镜下观察细胞形态。绘制细胞生长曲线,通过成脂及成骨诱导分化检测细胞分化能力并检测其CD29、CD34、 CD44、CD45的表达。取第3-4代细胞用于实验。2.2低氧处理脂肪来源干细胞:选取第3代ASCs,分别用含CoCl2的浓度为(0、50、100、200、400umol/L)的含10%胎牛血清的培养基培养。2.3MTT检测不同浓度的的CoCl2对细胞增殖的影响:分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同CoCl2浓度(0、50、100、200、400umol/L)和不同培养时间(Oh、6h、24h、48h、72h)培养条件下ASCs的增殖情况,计算各个浓度对细胞的生长抑制率,确立CoCl2低氧条件。2.4Western blot检测不同组中HIF-1α蛋白的表达:于不同的时间收集细胞,通过western blot实验检测低氧预处理后细胞中HIF-1α的表达。2.5油红O染色提取法来检测细胞的分化趋势:低氧处理脂肪来源干细胞后,每天在显微镜下观察,并于7d及14d后用油红O染色后,加入异丙醇溶液500ul/孔,震荡脱色10min,使细胞内染色甘油三酯充分溶解,酶标仪540nm处测光吸收值,检测各组细胞中的成脂肪分化的多少。2.6通过划痕实验及Transwell实验检测细胞的迁移能力:细胞划痕实验通过分为N组:常氧培养组;H组:低氧培养组;H+A组:低氧培养+AMD3100(5ug/ml)处理组;并对细胞迁移距离统计分析,观察缺氧对细胞迁移能力的改变。Transwell实验分为C组:正常对照组;N+SDF-1组:常氧培养组,下室含有SDF-1;H+SDF-1组:低氧培养组,下室含有SDF-1;H+SDF-1+A组:上室细胞低氧培养+AMD3100(5ug/ml)处理组,下室含有SDF-1;通过比较各组迁移细胞的数量而检测缺氧处理对细胞对SDF-1趋化能力的改变。2.7统计学方法:采用SPSS13统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较单因素方差分析,多因素交互效应使用析因分析。以p<0.05为有显著性差异。3实验结果3.1大鼠ASCs的原代培养与形态学观察:原代ASCs培养48h换液后,即可观察到贴壁细胞,细胞形态短小,呈长梭形。培养至4d,细胞明显增多、变长、变大,长梭型、纺锤形形态更加明显。传代培养中,细胞基本保持长梭型的形态。3.2细胞的鉴定结果:在标准成脂诱导条件下,油红染色证实其可向脂肪细胞分化;在标准成骨诱导条件下,茜素红染色可呈现桔红色的结节状物质,证实其向成骨细胞分化;流式细胞仪检测细胞表面抗原,结果显示CD29和CD44高表达,CD34及CD44低表达,符合脂肪来源间充质干细胞免疫表型。3.3不同浓度的CoCl2对ASCs增殖的影响:MTT检测发现在加入400umol/L、200umol/L浓度的CoCl2相比于空白对照组,ASCs的增殖能力受很大抑制(p<0.05);而100umol/L和50umol/L组脂肪干细胞的增殖能力并未产生明显影响,相比较于空白对照组,对ASCs没有抑制作用(p>0.05)。3.4不同浓度的CoCl2对ASCs的HIF-1α表达的影响:Western blot检测结果显示,HIF-1α蛋白在50umol/L和100umol/L组中的细胞均有表达,且均高于对照组的表达量,其中100umol/L组较50umol/L明显增高(p<0.05)。3.5不同浓度的CoCl2培养液对ASCs的成脂的影响:观察各组细胞在倒置显微镜下的形态,发现相比于对照组,CoCl2组呈较多脂滴。在对照组中,通过油红O染色后定量测量,发现与对照组比较,加入CoCl2的组中的ASCs的成脂肪趋势更加明显(p<0.05),而且脂滴大小和CoCl2浓度呈正相关。3.6经CoCl2培养后ASCs的迁移能力:通过Transwell显示细胞迁移实验显示,低氧预处理组穿过膜的细胞数(113.4±18.2)明显多于常氧组+SDF-1组穿过膜的细胞数(45.2±9.3),差异有统计学意义(p<0.05)。4结论4.1通过贴壁培养法可获得较高纯度的大鼠ASCs,细胞呈贴壁生长并且高表达CD29和CD44,低表达CD34及CD45;获得的细胞经过标准诱导条件下可诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞,可以满足体外实验要求。4.2利用化学低氧剂CoCl2建立低氧预处理ASCs实验模型,通过测量细胞抑制率显示细胞培养液CoCl2终浓度在100umol/L时不会对细胞的增值产生影响且同时能提高HIF-1α的表达。4.3CoCl2诱导的化学低氧预处理可促进ASCs自行的向脂肪细胞分化,而且脂滴形成速度及大小和CoCl2的浓度成正相关。4.4CoCl2诱导的化学低氧预处理可促进ASCs的体外迁移能力,其机制可能与低氧预处理后HIF-1α表达上调进而介导CXCR4(趋化因子受体4)表达增加有关。