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成熟红细胞主要是来源于造血干细胞多步骤分化的结果,从早期体积较大,核仁明显的原红细胞经过早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞阶段分化成无细胞核、体积较小的网织红细胞再到成熟的红细胞。在这个发育过程的晚期,红细胞的细胞核变得高度浓缩,转录活性逐渐降低直至消失。红细胞的脱核是哺乳动物所特有的过程,是红细胞分化晚期的一个关键步骤。红细胞脱核是指在晚幼红阶段,红细胞经过细胞核固缩、极化到最终细胞核排出的过程。其目的是最大限度的增加红细胞中血红蛋白量及确保红细胞能以较快的速度穿过比红细胞细小的毛细血管,同时易于改变其自身形状而不会受到机械破坏。这个分化成熟的过程受到很多转录因子的精密调控,Myc则是其中的一个重要调控因子。Myc是一个原癌基因,编码一个重要的转录因子。有研究认为Myc可以直接调控人类约15%的基因表达,是促进细胞增殖必需的重要的核蛋白。Myc在红细胞发育早期高表达,为红系早期原红细胞的增殖所必须,但是晚期红系发育的时候Myc的表达快速降低。然而Myc表达水平的高低是否影响红细胞的分化尚不清楚。microRNA(miRNA)是一类内源性小分子非编码RNA,长度仅为18-25个核苷酸。参与生长发育、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等一系列病理生理过程。miR-144/451是高度保守的双顺反子基因簇,这个基因簇编码两个非常保守的非编码小分子RNA,miR-451和miR-144。我们课题组前期研究证实miR-144/451主要表达在红细胞中,在红细胞中通过抑制14-3-3ζ和Cab39发挥抗氧化及抗凋亡的功能,miR-144/451的缺失,可以引起红细胞发育受损。但是miR-144/451是否参与红细胞的分化尚不清楚。如果能明确他们之间的关系将会为临床贫血治疗提供新的靶点。方法:使用miR-144/451基因敲除小鼠进行体内研究。使用5氟尿嘧啶(5-FU)体内注射用于消除小鼠造血系统中所有增殖的前体细胞。磁珠分选小鼠骨髓有核红细胞。使用G1E、MEL可诱导分化的红系细胞系及原代培养的小鼠胚胎肝来源的红系前体细胞进行体外研究。通过组织学、免疫组织化学检测小鼠红系前体细胞的数量。流式细胞术检测红细胞分化特别是脱核的过程。芯片技术用于确认Myc的调控功能。Western blot检测蛋白水平。qRT-PCR检测miR-144,miR-451及与红系分化相关基因的表达水平改变。使用双荧光素酶报告实验检测microRNA与Myc mRNA的绑定关系。结果:1.miR-144/451敲除的小鼠骨髓中有核的红系前体细胞数量明显增加。5-FU体内注射后,与正常小鼠相比,miR-144/451敲除小鼠外周血中网织红细胞出现的时间要晚2 d。形态学检查发现孕14.5 d的miR-144/451 KO小鼠胚胎肝中原红细胞培养48 h后脱核的细胞比例与正常WT小鼠相比,减少了约80%,而且红系前体细胞核固缩不明显。这些结果充分说明miR-144/451基因敲除后红系正常分化发生了障碍。2.骨髓有核红细胞芯片检测和GSEA(gene set enrichment analysis)分析发现,与正常小鼠相比miR-144/451敲除小鼠的有核红细胞中Myc的功能增强。miR-144/451缺失后骨髓有核红细胞和胚胎肝原红细胞中MycmRNA和蛋白表达水平均增高。这些结果说明miR-144/451的缺失激活了小鼠骨髓内有核红细胞中的Myc分子通路。3.通过可诱导分化的红系细胞系(G1E和MEL)及原代小鼠胚胎肝来源的红系前体细胞培养,发现在正常红系细胞发育过程中,Myc表达水平逐渐下降。在野生型小鼠胚胎肝来源的原红细胞中过表达Myc后,红系前体细胞的核固缩和脱核出现明显障碍。这些结果证明Myc持续过表达可以抑制红系前体细胞的分化导致核固缩和脱核障碍,证明Myc下降可能为红系分化所必需。4.在原代培养的miR-144/451 KO小鼠胚胎肝来源的原红细胞中通过RNA干扰方法敲低红系前体细胞中Myc水平后,发现红系前体细胞的核固缩和脱核障碍得到明显改善。5.双荧光素酶报告实验发现在G1E红系前体细胞中共表达Myc 3’UTR和miR-451后荧光素酶的活性降低了 29倍,说明Myc是miR-451的直接靶基因。结论:1.miR-144/451的缺失可以引起红系前体细胞分化受阻导致终末发育阶段核固缩和脱核障碍。2.在红系正常发育过程中,miR-144/451促进红细胞分化,部分原因是miR-451能够抑制Myc的表达。