【摘 要】
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目的:活血通络胶囊（HXTL）,又称复方生脉成骨胶囊,在临床上多用于预防无症状股骨头坏死（ONFH）的塌陷发生和进一步恶化。目前已有大量临床研究证明了HXTL良好的治疗效果,但相关基础研究尚未阐明其治疗股骨头坏死的具体机制。本研究,试图探讨HXTL是否通过ERα-Wnt/β-catenin通路促进人骨髓间充质干细胞（h BMSCs）成骨分化,加快股骨头坏死区的修复,从而预防股骨头坏死塌陷的发生和进
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目的:活血通络胶囊（HXTL）,又称复方生脉成骨胶囊,在临床上多用于预防无症状股骨头坏死（ONFH）的塌陷发生和进一步恶化。目前已有大量临床研究证明了HXTL良好的治疗效果,但相关基础研究尚未阐明其治疗股骨头坏死的具体机制。本研究,试图探讨HXTL是否通过ERα-Wnt/β-catenin通路促进人骨髓间充质干细胞（h BMSCs）成骨分化,加快股骨头坏死区的修复,从而预防股骨头坏死塌陷的发生和进一步恶化。方法:在体外,流式细胞术（Flow Cyto Metry,FCM）检测实验细胞中CD73、CD44、CD29、CD11b、CD45及人类白细胞抗原DR亚型（HLA-DR）的表达水平,以明确细胞是否为h BMSCs;MTT法测定不同浓度HXTL中h BMSCs的细胞增殖情况及活性;茜素红染色法和碱性磷酸酶活性测定法分别测定不同浓度HXTL下h BMSCs的相关成骨情况,以确定HXTL的最适浓度。在使用Wnt信号通路的特异性抑制剂DKK1和ER的高亲和力抑制剂ICI 182780处理或不处理的情况下:q PCR测定成骨相关标志基因Runx2、OPN、COL1、DLX5、BGLAP和ERα等的表达和成骨不同阶段Wnt/β-catenin通路相关标记基因β-catenin、TCF7、LEF1、C-MYC、CYCLIN D和C-JUN的表达;Western-blot测定p-β-catenin蛋白和β-catenin的表达水平;免疫荧光染色法观察h BMSCs中β-catenin的核易位情况。在体内,激素性股骨头坏死大鼠模型（SIONFH）的建立:实验采用18只SD大鼠,随机分为3组（n=6）:假手术组、SIONFH组和实验组。SIONFH组和实验组用甲基强的松龙（MPS）（20mg/kg/d）造模,每周注射双侧髋部三次,持续3周。假手术组大鼠双侧髋部注射相同浓度的DMSO。在第3天至第28天,实验组大鼠给予HXTL灌胃（0.63g/kg/d）,假手术组和SIONFH组给予相同剂量的0.9%生理盐水（NS）。在第28天收集大鼠股骨和腹主动脉的血清样本,进行微计算机断层扫描技术扫描（Micro Computed Tomography,Micro-CT）、骨组织形态计量学和ELISA分析。结果:体外实验:MTT、茜素红染色法和碱性磷酸酶活性测定法结果显示HXTL促进h BMSC增殖和成骨分化的最适浓度为10μg/ml;q PCR结果显示10μg/ml HXTL促进成骨相关基因Runx2、OPN、DLX5、BGLAP和ERα的m RNA表达,以及Wnt/β-catenin通路相关基因β-catenin、TCF7、Lef1、C-MYC、CYCLIN D和C-JUN的表达,其成骨作用受到ERα抑制剂ICI 182780和Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1的抑制。体内实验:Micro-CT分析显示HXTL显著减轻激素诱导的股骨头骨质丢失。在定量分析中,与SIONFH组相比,发现SIONFH+HXTL组BV/TV、Tb.N和Tb.Th明显升高,而Tb.Sp降低。此外,H&E染色证实了HXTL对体内骨细胞凋亡的抑制作用。血清ELISA结果显示,HXTL促进了血清中OPG,RANKL,β-catenin和血小板衍生因子-BB（PDGFBB）的表达,总之在大鼠体内HXTL促进成骨,抑制骨细胞凋亡。结论:HXTL对h BMSC增殖和成骨分化的促进作用,可能与ERα与Wnt信号通路的交互作用（Cross-talk）有关。本研究为进一步的临床研究和HXTL在治疗股骨头缺血性坏死中的应用提供了理论基础。
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