论文部分内容阅读
鉴于以往关于去整合素的功能及作用机制的相关报道,该论文对产于中国旅顺的白眉蝮蛇去整合素进行了研究.我们从产于中国旅顺的白眉蝮蛇(Agkistrodon halys brevicaudus stejneger)毒腺中提取总RNA,利用自行设计的引物进行RT-PCR扩增,获得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因.引物设计的依据是,根据NCBI上发表的蛇源去整合素的蛋白质同源序列反推回DNA序列,然后根据这段DNA序列设计两端引物.测序结果显示,其与韩国的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高:DNA序列同源性为95.8﹪,蛋白质序列同源性为91.8﹪,且蛋白质中含有去整合素的特征模体RGD及12个半胱氨酸.将去整合素基因进行克隆、转化与诱导后,得到了该蛋白的可溶性高效表达.经组氨酸亲和层析纯化,获得了分子量为9kD的均质蛋白,并将其命名为Adinbitor.利用人富含血小板血浆的测试系统进行的血小板聚集实验结果表明,rAdinbitor可呈剂量依赖性方式抑制ADP诱导的人血小板聚集.其抑制人血小板聚集的IC<,50>为6μmol/L.关于血管新生的实验结果表明,rAdinbitor能明显抑制由碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的人脐静脉血管内皮细胞株ECV304的细胞增殖,其IC<,50>为0.89μmol/L.rAdinbitor对ECV304细胞对纤连蛋白(fibronectin,FN)的黏附、穿过8.0μm孔径的多聚碳酸盐膜的迁移、透过人工基质膜的浸润及分化均有明显的抑制作用.进一步的细胞凋亡实验证明,rAdinbitor能呈剂量依赖的方式引起ECV304细胞的凋亡,说明rAdinbitor触发了整合素信号转导通路中的细胞凋亡信号.在体内外的血管生成模型上的实验结果显示,rAdinbitor可显著抑制bFGF诱导的于人工基质膜上的管样物生成及鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane,CAM)的血管生成.上述结果表明,rAdinbitor为血管新生的有效抑制剂.对C6神经胶质瘤细胞和B16黑色素瘤等肿瘤细胞作用的测定结果显示,rAdinbitor同样可以抑制肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移与浸润.同时其还可呈剂量依赖性方式诱导肿瘤细胞发生凋亡.通过对rAdinbitor对信号转导通路中FAK的表达及其磷酸化的测定结果表明,Adinbitor可有效抑制C6细胞的FAK表达,进而对FAK磷酸化也具有抑制作用.这充分证明rAdinbitor的信号转导途径是以通过抑制细胞整合素的信号转导为特征.说明其是通过封闭ECM与整合素的作用位点,阻止黏着斑的形成而对整合素的传导通路起到阻滞作用,进而引起细胞凋亡等一系列细胞信号反应的.总之,该论文成功地通过基因工程手段从中国旅顺的白眉蝮蛇毒腺中获得了一个去整合素家族的新成员rAdinbitor,并较为系统地对其生物学活性及信号转导途径进行了研究.所有这些实验结果都提示了rAdinbitor作为一种抗血栓或抗肿瘤新药的潜在应用价值.