食物加工贮藏过程中的各类物理、化学因素,以及脂质和糖类的氧化产物都极易引起蛋白质氨基酸残基侧链的多种氧化修饰,导致蛋白质结构和功能发生变化,影响食品的品质和营养功能。酪氨酸(Tyr)残基极易发生氧化或硝化修饰,并且酪氨酸氧化产物(tyrosine oxidized products,TOP)的结构稳定,不易被水解也不易被酶解,因此在加工肉制品和奶制品等含有蛋白质的食品中都检测到不同程度的TOP积累。近年的研究发现生物体系中产生的这些结构稳定的TOP可能会被错误地掺入生物体内的蛋白质合成途径,导致蛋白质功能障碍,产生细胞的毒性,这一过程与组织损伤以及多种代谢性疾病的发生密切相关。本实验室前期的工作探究了食物来源的TOP与机体损伤的关系,研究发现摄食含有TOP的氧化酪蛋白会导致小鼠组织产生氧化应激,并伴有双酪氨酸(Dityr)及晚期蛋白质氧化产物(AOPPs)在组织中的堆积。然而关于食物中的TOP如何引起组织中Dityr和AOPPs的积累,膳食TOP是否可以被机体消化吸收从而影响机体代谢,以及膳食TOP对机体消化器官、代谢器官的损伤作用及机制等问题尚不明确。因此,研究食物中含有的TOP对机体健康的影响及其分子机制,对丰富食物蛋白质营养理论、完善食品加工技术,提高人口健康素质具有重要的理论和实际意义。本课题主要通过体内外实验探讨食源性TOP的吸收特性,并通过大、小鼠的饲喂实验探讨摄食TOP对动物肝脏和肾脏的氧化应激和纤维化损伤及其作用机制。本实验利用H2O2-Cu体系(?OH)氧化Tyr得到的TOP,并且经过HPLC-MS分析发现实验中制得的TOP的主要成分是双酪氨酸(Dityr)和未被氧化的Tyr,其中Dityr含量约占总TOP的22%。接着通过HPLC分离纯化TOP中的Dityr,并经核磁检测确定收集的样品为Dityr纯品。运用Ussing-chamber模型对TOP进行体外模拟吸收测评,结果发现TOP的主要成分Dityr可以透过大鼠肠道被吸收。接着运用大鼠灌胃实验进一步评价TOP在大鼠体内的吸收,结果证明TOP中的Dityr可以被肠道吸收进入机体代谢循环,随着肝门静脉血进入肝脏,并且可以引起外周血中Dityr的含量升高。采用雌雄大鼠进行28天重复经口毒性试验初步评估TOP的经口安全性,研究发现灌胃雌、雄大鼠不同剂量TOP(50、250、1250 mg/kg体重/天)28天后,低剂量(50mg/kg体重/天)TOP对大鼠生长性能没有明显影响,但随着灌胃TOP剂量的增大(250、1250 mg/kg体重/天)及时间的延长(灌胃时间达到2 w以上),大鼠的食欲及生长性能都受到严重的阻碍。并且灌胃TOP剂量越大、时间越长,其损伤越明显。28天重复经口毒性试验结果还显示,灌胃TOP会导致雌、雄大鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平上升、总蛋白(TP)水平下降、肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平上升,并且肝脏及肾脏指数也出现不同程度增加,以上结果表明短期灌胃TOP会对大鼠的肝脏和肾脏功能产生明显的损伤作用。此外,灌胃TOP还会导致雌、雄大鼠血清及肝肾器官中抗氧化还原酶活性降低,并且肝肾组织中出现羰基、Dityr等蛋白氧化产物的积累,大鼠机体出现氧化应激损伤。对大鼠进行TOP长期饲喂实验,饲喂周期分别设定为6 w、12 w和24 w,TOP饲喂剂量分别设定为低剂量(2 g/kg饲料)、中剂量(4 g/kg饲料)和高剂量(8 g/kg饲料)。饲喂结果表明不同饲喂周期及不同饲喂剂量的TOP均造成大鼠采食量和体增长率的下降,大鼠血液、肝脏和肾脏中出现氧化应激损伤。TOP造成大鼠肝、肾氧化应激损伤激活了Nrf2-ARE通路来上调其下游相关抗氧化酶基因的表达以抵制机体受到的损伤,但是机体抗氧化酶活力却显著下降,表明机体氧化还原系统失衡。长期饲喂TOP还导致肝肾发生炎症反应,并且与肝、肾脏功能相关的血清生化指标明显升高,肝、肾组织中积累大量的蛋白质氧化和脂质氧化产物。大鼠机体各项指标的变化随着TOP饲喂周期的增长和剂量的增加而加剧。在各个实验周期内,Tyr处理组大鼠的各项数据与对照组动物相比没有明显差异。不同剂量(低剂量2 g/kg饲料、中剂量4 g/kg饲料、高剂量8 g/kg饲料)TOP饲喂大鼠24 w后,大鼠肝肾免疫组化(IHC)结果显示不同剂量TOP均造成大鼠的肝细胞索、肾小球、肾小囊和肾间质组织中出现剂量相关性的Dityr沉积。HE和Masson染色结果证实TOP引起大鼠肝、肾出现组织学上的纤维化病变,不同剂量的TOP均造成大鼠肝脏和肾脏组织中细胞外基质的(ECM)含量的上升,包括I型前胶原羧基末端肽(ICTP)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、层粘蛋白(LN)和透明质酸(HA),并且肝肾纤维化程度随TOP剂量的升高而加重。TOP诱导的大鼠肝肾纤维化是通过激活MAPKs/TGF-β1/Smads信号通路实现的。其中TOP主要引起肝脏MAPKs家族中ERK和p38磷酸化,同时引起肾脏MAPKs家族中JNK和p38磷酸化。10 w灌胃小鼠Dityr(1 mg/kg体重/天)和TOP(4.5 mg/kg体重/天)均造成小鼠肝、肾出现氧化应激损伤,肝、肾组织中出现蛋白及脂质氧化产物的累积。Dityr和TOP灌胃导致与小鼠肝、肾脏功能相关的指标发生显著变化,表明小鼠肝、肾功能发生明显损伤。HE和Masson染色结果证实Dityr和TOP灌胃均引起小鼠肝脏和肾脏出现组织学上的纤维化变病变,小鼠肝脏和肾脏组织中细胞外基质的(ECM)的含量上升。并且类似于大鼠TOP饲喂实验的结果,Dityr和TOP灌胃诱导的小鼠肝、肾脏纤维化病变也都是激活MAPKs/TGF-β1/Smads信号通路。其中Dityr和TOP主要引起肝脏MAPKs家族中ERK和p38磷酸化,同时引起肾脏家族中MAPKs家族中JNK和p38磷酸化。Dityr和TOP灌胃组小鼠之间各项指标没有差异,结果表明TOP诱导的肝、肾氧化应激损伤及纤维化病变主要是由Dityr引起的。综上所述,食物中TOP的主要产物Dityr可以被肠道直接吸收进入血液。长期摄入TOP会造成机体的氧化应激损伤和炎症反应,并激活Nrf2-ARE通路。摄入TOP会导致肝脏和肾脏功能损伤,并通过触发MAPKs/TGF-β1/Smads信号通路导致肝脏和肾脏组织产生纤维化病变。肝、肾受损程度随着TOP摄食时间的延长和剂量的增加而增大。另外,Dityr的摄入对肝、肾产生的损伤及作用机制与TOP类似,表明Dityr在TOP诱导的肝肾损伤中起主导作用。