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多倍体在植物界广泛存在,其在物种演化和植物分类领域中起着重要的作用,在已知枣(Ziziphus jujuba Mill.)种质资源中,赞皇大枣是唯一的自然三倍体,表现果大、高产和适应性强等优点；枣近缘种毛叶枣(Ziziphus mauritiana Lam.)的栽培品种多为四倍体,也表现相似的优点,因此对枣树进行多倍化研究具有广阔的前景。多倍化一般分为无性多倍化(体细胞染色体加倍获得多倍体)和有性多倍化(借助2n配子在种内或者种间交配获得多倍体),无性多倍化一般通过使用减数分裂抑制剂,如秋水仙素、氨磺乐灵、氟乐灵等来促使体细胞染色体加倍,由于缺乏亲本间染色体的重组,从而限制了遗传多样性的发生；利用有性多倍化途径进行多倍体育种比无性多倍化具有更高的效率。目前已经在观赏植物、谷物、马铃薯、果树以及其它多种作物中利用2n配子获得了有性多倍体。本研究通过对枣树2n花粉发生的细胞学机制及2n花粉的诱导技术等进行研究,以期为利用2n花粉进行枣的有性倍性育种提供理论基础和技术指导。主要研究结果如下:
1.研究了自然条件下2n花粉比例较高的‘铃铃枣’的2n花粉发生的细胞学机制。‘铃铃枣’减数分裂终变期有12个二价体,减数第一次分裂表现正常；但是,在减数第二次分裂的中期Ⅱ,纺锤体定位异常,除正常定位的垂直纺锤体外,还出现平行纺锤体和三极纺锤体。垂直纺锤体、三极纺锤体和平行纺锤体比例分别为72.93％、17.22％和9.85％。垂直纺锤体和三极纺锤体分别形成四分体和三分体,而平行纺锤体分为两类:Ⅰ和Ⅱ,只有平行纺锤体Ⅱ(融合纺锤体)与二分体之间是显著相关的,这意味着只有融合纺锤体导致了二分体的发生,而平行纺锤体Ⅰ只形成了‘田’字形的四分体。四分体时期观察到四分体、三分体和二分体比例分别为80.99％、16.40％和2.61％,理论上1个四分体产生4个n花粉,1个三分体产生1个2n花粉和2个n花粉,1个二分体产生2个2n花粉,由此估测2n花粉比例为5.71％,而实测2n花粉比例为6.15％,二者之间没有显著差异。表明,‘铃铃枣’中期Ⅱ平行纺锤体和三极纺锤体的出现导致了二分体和三分体的发生进而导致了2n花粉的形成。这种类型的2n花粉为FDR型,具有较高的育种价值。自然条件下不能产生2n花粉的‘辣椒枣’,减数分裂过程表现正常,四分体时期无三分体和二分体出现。
2.利用涂抹法研究了自然条件下2n花粉比例低的‘赞皇大枣’和自然条件下无2n花粉产生的‘辣椒枣’较适宜的2n花粉诱导时间和秋水仙素浓度。结果表明,‘赞皇大枣’较适宜的2n花粉诱导时间为花前16 d(花蕾大小为1.82mm),浓度为0.1％时,2n花粉比例从0.02％提高到1.18％；‘辣椒枣’较适宜的2n花粉诱导时间为花前15 d～18 d(花蕾大小为1.69mm),浓度为0.1％时,2n花粉比例从0提高到0.03％。但是不同秋水仙素浓度(0.1％～0.7％)的诱导效果没有显著差异。
3.借助涂抹法,利用0.5％秋水仙素对优良父本‘不落酥’、‘相枣’、‘灰枣’、‘壶瓶枣’、‘大荔龙枣’、‘磨盘枣’进行了2n花粉诱导。结果表明,‘不落酥’花前18 d(花蕾大小为0.90mm)的2n花粉诱导效果显著好于其它日期,2n花粉比例可达4.97％；‘灰枣’花前15 d～18 d(花蕾大小1.29mm)的2n花粉诱导效果好于其它日期,2n花粉比例可由0提高到2.48％；‘相枣’花前15 d～19 d(花蕾大小为1.60mm和1.06mm)的2n花粉诱导效果好于其它日期,2n花粉比例可由0提高到0.49％；经过秋水仙素处理的‘壶瓶枣’,只在5月31日观察到3个2n花粉；经秋水仙素处理的‘磨盘枣’和‘大荔龙枣’均未获得2n花粉。二者2n花粉诱导效果不好,可能是由于品种花蕾过大或过小导致错过了适宜的诱导时期。综上,花前15d～19d为较适宜的2n花粉诱导时间,具体时间因品种而略有不同。
4.鉴于涂抹法的2n花粉诱导效果不佳,研发了基于微创技术的枣树2n花粉诱导技术,建立了枣树杂交育种优良亲本‘蜂蜜罐’(自然条件下不产生2n花粉)的2n花粉高效诱导技术。具体操作为:******。蕾裂期检测2n花粉比例,得适宜秋水仙素诱导时期为花前**d～**d,秋水仙素处理的适宜浓度是**％、处理时间为**h,2n花粉的比例可达**％、活力高达**％、离体条件下活力与n花粉无差异。0.05％～0.7％秋水仙素均可以引起枣吊叶片的褐化,以0.7％秋水仙素引起的褐化率最高,可达20.43％。这种现象一方面说明秋水仙素可以被吸收入花蕾中,另一方面说明高浓度秋水仙素对花蕾具有不利影响。