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目的和意义急性白血病(acute leukemia, AL)是一组造血系统恶性克隆性疾病,常伴有获得性、再现性染色体异常,它们是AL诊断分型、制定治疗方案及微小残留病(minimal residual disease, MRD)监测的重要依据。大约55%的AL患者可检测到再现性染色体异常,其中最常见的是染色体易位。一些编码转录因子的基因常因染色体易位被破坏,并与其伙伴基因一起转录翻译成新的融合蛋白,干扰造血细胞增殖、分化及凋亡的正常调控途径,从而促使AL发病或病情进展。参与编码转录因子CBFα的基因RUNX1 (别名:AML1)是AL相关染色体易位中最常受累的基因之一,且能与多种基因发生易位,迄今报道涉及AML1的平衡易位已达30余种,近20种伙伴基因被成功克隆,其伙伴基因的种类还在不断被丰富。本研究拟从一例伴t(11;21)(q12;q22)的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)的遗传学特点入手,定位克隆AML1的新伙伴基因及融合基因,并对其进行初步功能研究,以深化我们对AML1相关融合基因致白血病发生、发展机制的认识,从而有助于指导该类疾病的诊断、治疗和预后评估。方法1.通过R显带和G显带技术对一例AML-M2患者骨髓标本及PHA刺激的外周血标本进行核型分析;采用染色体涂染(chromosome painting, CP)及多色荧光原位杂交(multiplex-fluorescence in situ hybridization, M-FISH)验证核型分析结果;采用AML1-ETO双色双融合探针单独或联合11号染色体涂染探针进行双色FISH初步检测位于21q22的受累基因;利用RT-PCR检测AML1-ETO融合基因的表达以初步排除t(8;21)变异易位。随访10个月后对其临床特征进行总结。所有实验均获得患者知情同意。2.采用3’-cDNA末端快速扩增(3’-Rapid Amplification of cDNA Ends, 3’-RACE)技术克隆该易位中AML1的新伙伴基因(位于11q12的LPXN基因);通过RT-PCR以AML1和LPXN基因特异性引物从患者骨髓标本扩增融合基因AML1-LPXN及LPXN-AML1转录本;设计同一基因位于易位断裂点两侧的引物以RT-PCR检测患者未被累及的AML1及LPXN等位基因的表达;根据后续功能研究的需要分别将AML1B、LPXN、AML1-LPXN(代表转录本AL、ALs)及LPXN-AML1的全长编码区(coding sequence, CDS)克隆到真核表达载体pEGFP-N1及pcDNA3.1/myc-his B ,将CBFβ全长CDS分别克隆到pDsRed2-C1及pcDNA3.1/myc-his B载体。所构建的全部克隆均送测序鉴定。3.采用瞬时转染观察野生型AML1B、CBFβ、LPXN及融合基因AL、ALs、LPXN-AML1翻译成的蛋白在NIH3T3细胞中的亚定位。4.利用电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)观察融合蛋白AL、ALs与含AML1核心序列的DNA探针的结合;采用荧光素酶报告基因实验观察融合蛋白对野生型AML1B转录活性的影响。5.筛选稳定高表达LPXN基因及融合基因AL、ALs、LPXN-AML1的NIH3T3细胞,通过绘制生长曲线、软琼脂集落形成实验和BALB/c裸鼠皮下成瘤实验观察这些基因对正常NIH3T3细胞的恶性转化能力。结果1.常规核型分析从该例患者骨髓标本检测到一种新的染色体异常:t(11;21)(q1?3;q22),其经PHA刺激的外周血标本为正常核型。染色体涂染及M-FISH证实11号、21号染色体发生相互易位。AML1-ETO双色双融合探针FISH检测发现该易位中21q22上受累的基因是AML1,而位于8号染色体的ETO基因未被累及。AML1-ETO探针联合11号染色体涂染探针双色FISH结果证实一条AML1基因发生断裂,并与11号染色体来源的DNA片段并置。RT-PCR未检测到AML1-ETO融合基因。该患者对化疗不敏感,生存期仅10个月,预后较差。2. 3’-RACE结果显示该易位中AML1的伙伴基因是位于11q12的LPXN,RT-PCR检测到4种AML1-LPXN转录本及1种LPXN-AML1交叉转录本,并将该易位基因组水平的断裂点定位至AML1第6内含子、LPXN第8外显子第835、836个碱基之间及第9外显子第984、985个碱基之间。该易位中未被累及的AML1及LPXN等位基因仍正常表达。各种真核表达载体中插入片段的序列、方向均正确,各目的基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)均未改变。3.目的蛋白亚细胞定位结果显示:和文献报道的一致,AML1B蛋白定位于细胞核;CBFβ蛋白在整个细胞均有表达,但以胞浆为主;LPXN蛋白定位于细胞浆;AML1-LPXN代表性转录本AL及ALs表达的蛋白均定位于细胞核;LPXN-AML1蛋白定位于细胞浆;当分别与不同剂量AML1B、AL、ALs共转染时,CBFβ蛋白从主要定位于胞浆变为完全定位于细胞核。4. EMSA结果表明:AML1-LPXN的转录本AL及ALs能与含AML1核心序列的DNA探针发生特异性结合,CBFβ与之共转染能增强这一结合。荧光素酶报告基因结果显示:AML1-LPXN的转录本AL及ALs呈剂量依赖性抑制AML1B对巨噬细胞集落刺激因子受体(macrophage colony stimulating factor receptor, M-CSFR)启动子的转录激活作用。5.稳定高表达转录本AL、ALs、LPXN-AML1及LPXN基因的NIH3T3细胞较仅表达pEGFP-N1空载体的NIH3T3细胞增殖迅速,能在软琼脂上呈克隆性生长,并能在BALB/c裸鼠皮下成瘤。结论1.发现一种累及AML1基因的新获得性染色体易位:t(11;21)(q1?3;q22)。2.该易位中AML1的伙伴基因是位于11q12的LPXN,故其核型应重新描述为t(11;21)(q12;q22)。易位形成4种AML1-LPXN转录本及1种LPXN-AML1转录本。该易位基因组水平的断裂点分别位于AML1第6内含子、LPXN第8外显子第835、836个碱基之间及第9外显子第984、985个碱基之间。3.与野生型AML1B蛋白一样,AML1-LPXN的转录本AL及ALs表达的蛋白位于细胞核内,且能与CBFβ发生亚细胞水平共定位,因而可能会与野生型AML1B蛋白竞争性结合CBFβ并抑制其转录活性。而LPXN-AML1蛋白定位于细胞浆,对AML1B蛋白的转录活性可能无明显影响。4. AML1-LPXN可能通过竞争性结合AML1B特异性靶DNA序列抑制AML1B对M-CSFR启动子的转录激活作用。5. AML1-LPXN的转录本AL和ALs、LPXN-AML1及LPXN表达的蛋白能使NIH3T3细胞获得增殖优势及恶性转化能力。