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银耳芽孢是银耳(Tremella fuciformis)担孢子芽殖产生的酵母状分生孢子,可通过芽殖方式无限繁殖,且生长快速、易于培养与转化,具备作为生物反应器的潜质。目前已有多种基因在银耳芽孢中表达成功,但是表达量偏低,缺乏安全有效的抗性筛选标记,表达体系尚不完善;目前实验室已在银耳芽孢中成功获得rfp基因的表达,但是HIV-TAT-survivin(T34A)突变体基因(TAT-survivin(T34A))未表达成功。为改善这些问题,本研究以PNP(经酵母表达载体pPICZA改造而成)为表达载体,以lacZ基因为报告基因,通过替换外源基因表达启动子的方法构建银耳芽孢外源基因表达载体,通过比较β-半乳糖苷酶活性筛选最佳启动子,采用该启动子构建rfp基因与TAT-survivin(T34A)的融合表达载体表达TAT-survivin(T34A)蛋白。具体内容与结果如下:1.外源基因表达载体、筛选标记与转化方法的选择通过比较pCAMBIA1301、PNP载体的转化效果以及潮霉素B、zeocinTM抗生素筛选效果,发现银耳芽孢对zeocinTM敏感,最低筛选浓度为25μg·mL-1 PNP载体更适合用于银耳芽孢外源基因的表达,电击转化法更适合银耳芽孢的转化。成功扩增出TEF1-EM7(PNP载体上zeocin抗性基因启动子组合)以及lacZ基因,成功构建含TEF1-EM7启动子的表达载体pPZ-lacZ及不含外源基因表达启动子的PNP-lacZ表达载体;通过电击转化法将载体pPZ-lacZ、PNP-lacZ转入银耳芽孢中,成功获得阳性转化子;转入pPZ-lacZ载体的阳性克隆中,筛选到lacZ基因可以正常表达的转化子,而转入PNP-lacZ载体的转化子lacZ基因均不能够正常表达;结果证明,PNP载体可以用于外源基因的表达,所扩增的lacZ基因本身不含可调控其表达的启动子,以PNP为表达载体、lacZ基因为报告基因可以用于外源基因表达启动子的筛选。2.含不同启动子及lacZ基因的表达载体的构建成功获得 CaMV35s、CaMV35s2、gpdⅡ、RP27、gpd-Tf、AOX Ⅰ、GAP 7个启动子以及lacZ基因,以PNP为出发载体分别构建含以上启动子及lacZ基因的表达载体,并分别命名为p35s-lacZ、p35s2-lacZ、pgpdⅡ-lacZ、pRP27-lacZ、pgTf-lacZ、pAOXⅠ-lacZ、pGAP-lacZ。经酶切、PCR、测序验证,表达载体构建成功。3.含不同启动子及laacZ基因的表达载体转化银耳芽孢及表达验证通过电击转化法将第二章构建的质粒载体转入银耳芽孢中,鉴定结果表明所有载体均已转化成功,转化率达700个/μg质粒DNA,平板显色结果显示,p35s-lacZ、pRP27-lacZ、pAOXⅠ-lacZ、pgpdⅡ-lacZ四个载体lacZ基因可以表达,分别获得17、23、8、3个的转化子,表达率仅达0.3%,其中含pgpd Ⅱ-lacZ载体的转化子lacZ基因表达缓慢且表达量非常低,而其余转化子表达时间段且表达量相对较高。通过 ONPG 比色法测定 p35s-lacZ、pRP27-lacZ、pAOX Ⅰ-lacZ三个载体转化子的β-半乳糖苷酶酶活,比较CaMV35s、RP27、AOX Ⅰ三个启动子在银耳芽孢中表达外源基因的强弱(由于pgpdⅡ-lacZ载体的转化子表达量极低且表达极缓慢所以未列入比较)。β-半乳糖苷酶酶活测定结果表明,RP27、AOXⅠ两个启动子表达效果明显强于CaMV35s启动子,RP27、AOXⅠ两个启动子表达效果相差不显著,AOX Ⅰ启动子略强于RP27启动子。4.rfp基因与TAT-survivin(T34A)基因的融合表达载体的构建及表达验证设计rfp与TAT-survivin(T34A)基因的融合表达基因,以PNP-RP27、PNP-AOX1为出发载体,成功构建含rfp基因与TAT-survivin(T34A)基因的融合表达载体 pRP27-RS、pAOXⅠ-RS,电击转化银耳芽孢。荧光显微镜观察可以观察到pRP27-RS、pAOX Ⅰ-RS两个载体转化子具有红色荧光,PCR可获得目的基因条带,SDS-PAGE电泳显示该融合蛋白大小约为44KDa,大小与理论预测值相吻合;结果表明融合基因已经成功整合到银耳芽孢基因组中,并且得到了表达。