SOCS3抑制STAT5a信号通路调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳

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研究泌乳相关信号通路中的信号分子与乳腺泌乳与增殖的关系,寻找与泌乳相关的重要节点分子,将有助于完善乳蛋白和乳脂合成的基因调控网络,为奶牛乳品质和乳产量的提高提供实验依据及新途径和新方法。SOCS3是细胞因子诱导的细胞因子信号通路的负调节因子,众多实验己证实它是信号转导与转录激活子5(STAT5)的抑制剂,但在奶牛乳腺上皮细胞中还尚未确定。乳腺中,受催乳素受体(PRLR)调控的JAK2/STAT5a信号通路对泌乳起关键作用,因此,SOCS3是否参与PRLR-JAK2-STAT5a信号通路调控泌乳是本研究关注的重点。此外,SOCS3可能通过调节SREBP-1c参与乳脂的合成。本实验我们分析SOCS3对JAK2-STAT5a信号通路的调控,进一步探讨这种选择性抑制作用对JAK2/STAT5a信号通路下游信号传递的影响,从而探讨SOCS3基因调控对奶牛乳腺上皮细胞的泌乳与增殖的作用机制。本实验以奶牛乳腺上皮细胞为模型,研究SOCS3的功能及其与STAT5a的相互作用,对SOCS3基因进行过表达和抑制,通过构建SOCS3真核表达载体或SOCS3siRNA,分别以脂质体转染至乳腺上皮细胞中,CASY-TT检测转染前后细胞增殖的变化;过表达和抑制SOCS3后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR), Western blotting检测JAK2/STAT5a活性,β-casein表达与合成,乳蛋白合成关键基因(mTOR)和乳脂合成关键基因(SREBP-1c, FAS, ACC, SCD) mRNA和蛋白水平的表达变化;过表达和抑制SOCS3后,细胞免疫荧光染色法检测STAT5表达及其亚细胞定位的改变;为进一步研究SOCS3与STAT5a的相互作用,我们同时抑制STAT5a基因,用qRT-PCR, Western blotting检测SOCS3及β-casein的表达变化,此外,在乳腺上皮细胞中添加L-蛋氨酸,调控细胞泌乳水平,检测SOCS3及泌乳相关蛋白的表达变化。实验结果显示,CASY-TT检测表明SOCS3降低细胞的增殖能力与细胞活力。过表达和基因沉寂SOCS3后,我们结合qRT-PCR和Western blotting检测结果发现SOCS3通过JAK2/STAT5a通路显著调节乳蛋白的合成。同时我们检测到SOCS3的过表达也下调SREBP-1c的表达和乳脂合成。荧光染色表明SOCS3在奶牛乳腺上皮细胞的细胞质和细胞核中表达;过表达SOCS3后,核内的SOCS3显著升高,核内STAT5a明显受到抑制;反之抑制SOCS3后,细胞核内的STAT5a增加,这与Western blotting结果一致。抑制STAT5a后,SOCS3的表达也随之下调,这表明SOCS3可能是转录因子STAT5a的靶基因。奶牛乳腺上皮细胞中添加L-蛋氨酸导致了SOCS3表达的下降。总之,我们的研究表明SOCS3是JAK2/STAT5a信号通路的抑制剂,其基因表达受STAT5a调控,因此认为SOCS3通过负调控抑制乳蛋白基因转录影响乳蛋白表达。同时SOCS3下调SREBP-1c和乳脂合成相关酶基因的表达,并且阻断乳脂合成。这些实验结果都是SOCS3参与乳蛋白和乳脂合成的有力证据,并且表明正常奶牛乳腺上皮细胞中SOCS3低表达是合成乳蛋白和乳脂的必要条件。
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