目的:探讨细菌生物被膜（bacterial biofilm,BBF）对大肠埃希菌单耐药、多耐药的影响,以及细菌耐药与BBF面积、厚度之间的相关性。希望通过对大肠埃希菌BBF的分析,为临床治疗细菌多耐药提供更多的思路和参考数据。同时初步探讨BBF的检测方法。方法:收集临床分离的大肠埃希菌110株,经23种抗生素药敏试验,把细菌分为三组:药物敏感组29株（对抗生素均敏感）;单耐药组21株（一种或一类抗生素耐药）;多耐药组60株（三类及以上抗生素耐药）。每株细菌与三份无毒、透光医用生物膜（1.5 mm）在相同条件下培养。通过对BBF黏附、集聚、成团生长特点进行结果观察。三份膜片分别进行:（1）扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）喷金细菌表面,观察BF表面结构,以扫描电镜1000倍测BBF阳性程度,面积用Image-Pro Plus 6.0分析,采用统计学的百分位数法,以P25、P50、P75为界点,将菌株面积划分为四个等级,由此得到P₂₅=480,P₅₀=1290,P₇₅=1700,参照H-score评分法评分:（1）阳性程度（A）的评分:少量粘附,0分;小块状集聚（﹤480μm2）,1分;中块状集聚（481～1290μm²）,2分;较大块状集聚（1291～1700μm²）,3分;大块状集聚（>1701μm2）,4分。（2）BBF阳性所占比例（B）的评分:B<5%,1分;5%≤B<35%,2分;B≥35%,3分。每个标本三个随机视野,每个视野以最大BBF评A分。以A和B的乘积表示BBF在该标本中的表达量。积分求平均值。平均积分1≤AB≤3分为（+）,3<AB≤6分为（2+）,6<AB≤9分为（3+）,AB﹥9-12为（4+）,各实验组用相同的标准评判。（2）硝酸银染色:BBF蛋白成分琉基、碳基等基团被碱性环境下还原成银,染成黑色。光学显微镜200倍镜下做同条件比较（物镜20倍、目镜10倍）,面积用Image-Pro Plus 6.0分析,采用统计学的百分位数法,以P25、P50、P75为界点,将菌株的面积划分为四个等级,由此得到P25=525,P50=1320,P75=1750,参照H-score评分法评分:（1）阳性程度（A）的评分:空白或黑点散在分布,0分;小块状黑色集聚（面积﹤525μm2）,1分;中块状黑色集聚（面积526～1320μm²）,2分;较大块状黑色集聚（面积1321～1750μm²）,3分;大块状集聚（面积>1751μm2以上）,4分。（2）BBF阳性所占比例（B）的评分:B<5%,1分;5%≤B<35%,2分;B≥35%,3分。以A和B的乘积表示BBF在该标本中的表达量。每个标本三个随机视野,每个视野以最大BBF评A分。积分求平均值。平均积分1≤AB≤3分为（+）,3<AB≤6分为（2+）,6<AB≤9分为（3+）,AB﹥9-12为（4+）。⑶激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）扫描SYTO9/PI荧光染液染色后的BBF厚度。每个视野扫描8～32层,随机扫描3个视野,求平均值（μm）。⑷三种实验结果进行统计学分析:SEM、银染法统计推断采用秩和检验和LSD法（Fisher’Least Significant Difference）对各组进行两两比较。实验结果变量（即等级顺序）=0、1、2、3、4,分别表示BBF“-”、“+”、“2+”、“3+”、“4+”;积分结果采用秩和检验和LSD法对各组进行两两比较;CLSM采用x±s进行统计描述,统计推断采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,若P<0.05,进而采用LSD法对各组进行两两比较;SEM、银染法、CLSM法两变量（细菌耐药与BBF阳性程度）之间的相关分析采用Spearman等级相关,即实验结果变量（即等级顺序）=0、1、2、3、4,分别表示BBF“-”、“+”、“2+”、“3+”、“4+”;分组变量,药物敏感组=1、单耐药组=2、多耐药组=3。结果:⑴扫描电镜结果:检测110株细菌,阳性菌株97株,阳性率为88.2%。药物敏感组29株“-”7株、“+”14株、“2+”7株、“3+”1株、“4+”0株,平均每株2.38±2.19分;单耐药组21株“-”4株、“+”10株、“2+”5株、“3+”1株、“4+”1株,平均每株2.86±2.88分;多耐药组60株细菌“-”2株、“+”5株、“2+”15株、“3+”16株、“4+”22株,平均每株7.62±3.23分。对三组等级数据进行秩和检验,χ2=45.96（P<0.05）,进而进行两两比较,对积分进行秩和检验,χ2=49.82（P<0.05）,进而进行两两比较。结果?药物敏感菌株组与单耐药组:P>0.05差异无统计学意义。?药物敏感菌株组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。?单耐药组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。⑵银染法结果:检测110株细菌,阳性菌株101株,阳性率为91.8%。药物敏感组29株,“-”5株、“+”15株、“2+”8株、“3+”1株、“4+”0株,平均每株2.45±1.88分;单耐药组21株,“-”3株、“+”6株、“2+”10株、“3+”1株、“4+”1株,平均每株3.14±2.47分;多耐药组60株,“-”1株、“+”7株、“2+”15株、“3+”16株、“4+”21株,平均每株7.53±3.38分。三组等级数据进行秩和检验,χ2=40.57（P<0.05）,进而进行两两比较。对积分进行秩和检验,χ2=45.57（P<0.05）,进而进行两两比较。结果?药物敏感菌株组与单耐药组:P>0.05差异无统计学意义。?药物敏感菌株组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。?单耐药组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。⑶CLSM结果:药物敏感组、单耐药组、多耐药组BBF平均厚度分别为25.91±5.84μm、31.84±4.91μm、47.97±9.53μm。对各组层扫BBF厚度,进行单因素方差分析,结果显示:F=48.70（P<0.05）,进而进行两两比较。结果?药物敏感组与单耐药组:P>0.05差异无统计学意义。?药物敏感组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。?单耐药组与多耐药组:P<0.05差异有统计学意义。⑷多耐药组结果:对多耐药组耐三类药物（7株）、耐四类药（26株）、五类及以上耐药（27株）进行分析。SEM耐三类药“-”1株、“+”3株、“2+”2株、“3+”1株、“4+”0株,平均积分为3.86±2.67分;耐四类药“-”1株、“+”1株、“2+”7株、“3+”7株、“4+”10株,平均积分为7.85±3.14分、五类及以上“-”0株、“+”1株、“2+”6株、“3+”8株、“4+”12株,平均积分为8.37±2.72分。银染耐三类药“-”1株、“+”3株、“2+”2株、“3+”0株、“4+”1株,平均积分为4.14±3.63分、耐四类药“-”0株、“+”2株、“2+”7株、“3+”9株、“4+”8株,平均积分为7.61±2.94分、五类及以上“-”0株、“+”2株、“2+”6株、“3+”7株、“4+”12株,平均积分为8.13±3.07分;CLSM平均厚度35.69±6.03μm、46.73±9.55μm、52.38±13.81μm。对SEM、银染法等级结果进行秩和检验,χ²=11.22（P<0.05）、χ2=8.20（P<0.05）,进而LSD法进行两两比较;对SEM、银染法积分结果进行秩和检验,χ²=9.57（P<0.05）、χ²=6.70（P<0.05）,进而LSD法进行两两比较;对CLSM结果进行单因素方差分析F=6.19（P<0.05）进而进行两两比较。三种方法等级结果与积分结果统计学分析均显示(三类耐药与四类耐药差异有统计学意义（P<0.05）;(三类耐药与五类耐药差异有统计学意义（P<0.05）;(四类耐药与五类耐药差异无统计学意义（P>0.05）。⑸细菌耐药与BBF阳性程度（面积和厚度）的相关性结果:SEM、银染结果（面积）相关系数分别为R_S=0.64（P<0.05）、R_S=0.63（P<0.05）,积分相关系数分别为R_S=0.65（P<0.05）、R_S=0.64（P<0.05）;细菌耐药程度与CLSM结果（厚度）相关系数R_S=0.86（P<0.05）。结论:初步得出如下结论⑴BBF的形成在细菌中带有普遍性:SEM阳性率为88.2%;银染阳性率为91.8%。⑵BBF对大肠埃希菌单耐药影响较小,推测它不是单耐药菌株产生耐药的主要原因:药物敏感组和单耐药组之间差异无统计学意义。⑶BBF对大肠埃希菌多耐药有一定影响:虽然耐药种类越多的细菌耐药机制越复杂,但统计学分析结果显示,多耐药组与药物敏感组、单耐药组之间的差异有统计学意义。⑷BBF面积、厚度与大肠埃希菌耐药性呈正相关:SEM、银染相关系数分别为RS=0.64（P<0.05）、R_S=0.63（P<0.05）,积分相关系数分别为R_S=0.65（P<0.05）、R_S=0.64（P<0.05）;细菌耐药程度与CLSM结果相关系数R_S=0.86（P<0.05）。提示BBF形成面积越大、厚度增加,它对细菌耐药的影响可能会越大。⑸实验方法的初探:三种方法虽然各有其优缺点,但实验结果较为一致。SEM直观,可以看见BBF,结果准确度较高。银染法仪器、试剂要求不高,实用普通实验室。激光共聚焦显微镜有具体的厚度数据,更适合做组与组之间的比较。