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目的自噬是维持细胞稳态的重要生理过程。我们之前研究发现高剂量中波紫外线(50 mJ/cm2)辐照的角质形成细胞自噬水平降低。棉子糖是一种天然三糖,不仅能作为新型自噬诱导剂,也是一种调节多样环境应激的平衡剂。自然界的中波紫外线是造成皮肤损伤最常见的环境应激源。然而,关于棉子糖是否能通过自噬活化通路发挥保护中波紫外线应激的作用尚未明确。本研究主要首先明确了棉子糖对中波紫外线辐照后人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)生物学效应(细胞增殖、细胞存活、细胞死亡)。接着进一步探讨棉子糖对中波紫外线辐照后人永生化角质形成细胞自噬水平及其重要的MTOR信号通路活化情况。最终明确自噬相关信号通路在棉子糖发挥对皮肤中波紫外线应激的保护的作用。方法主要以人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)为研究对象1、建立中波紫外线照射HaCaT细胞损伤模型,并通过全基因组测序检测中波紫外线诱导细胞DNA突变的情况;2、检测中波紫外线损伤的生物学效应:通过乳酸脱氢酶释放试验、台盼蓝染色、平板克隆实验及免疫印迹方法分别检测细胞毒性、细胞活性、细胞增殖克隆水平及凋亡或死亡相关蛋白(Caspase-3的剪切体,PARP的剪切体,AIF,Endo G),利用以上指标分析棉子糖抗中波紫外线损伤的生物学效应;3、检测自噬水平及信号通路变化情况:i)自噬流水平的变化:联合自噬流分析工具药(E64d和pepstatin),通过免疫印迹方法检测自噬标志性分子LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达变化,通过吖啶橙(AO)染色检测细胞内酸性囊泡的数量,通过CYTO-ID自噬染色后流式分析染色水平;ii)自噬信号通路的变化:通过免疫印迹方法检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MTOR)蛋白表达及其ser2448磷酸化产物水平,分析MTOR活性;同时检测MTOR下游重要信号分子表达水平(p70 S6 Kinase,S6 Ribosomal Protein,4E-BP1);4、在棉子糖干预中波紫外线照射后HaCaT细胞体系中,阻断自噬后,检测细胞的生物学效应:运用自噬抑制剂渥曼青霉素阻断自噬或通过小分子核酸干扰技术敲低ATG5阻断自噬后,再以乳酸脱氢酶释放试验检测细胞毒性,进一步分析自噬通路在棉子糖抗中波紫外线损伤中的作用。结果1、小剂量中波紫外线(10 mJ/cm2)照射后24小时的HaCaT细胞与传代2次后的HaCaT细胞中存在655个相同的DNA变异,这些突变的基因富集通路可涉及细胞凋亡等通路;线粒体尚未发现有可遗传的突变;2、在中波紫外线(50 mJ/cm2)诱导HaCaT细胞损伤模型中,棉子糖干预12小时能降低乳酸脱氢酶释放水平,台盼蓝染色阳性比率;但对平板克隆增殖,凋亡相关蛋白(Caspase-3,PARP,AIF,Endo G)无明显作用;3、100 mM棉子糖干预12小时能增加HaCaT细胞中自噬标志蛋白LC3 Ⅱ表达,CYTO-ID染色流式分析绿色荧光平均强度增加;而且,联合自噬流分析工具药(E64d+pepstatin),棉子糖处理能够促进HaCaT细胞自噬标志蛋白分子LC3 Ⅰ型转化成LC3 Ⅱ,吖啶橙染色示酸性囊泡增多。4、棉子糖干预HaCaT细胞后MTOR信号通路中MTOR及p-MTOR Ser2448蛋白表达无明显变化,MTOR下游重要信号分子4E-BP1蛋白及其相应磷酸化蛋白p-4E-BP1 Ser65表达均无明显变化。5、棉子糖干预也能促进中波紫外线损伤的HaCaT细胞的自噬标志蛋白分子LC3 Ⅰ型转化成LC3 Ⅱ,吖啶橙染色的酸性囊泡增多。6、通过渥曼青霉素阻断自噬流后,棉子糖干预能降低中波紫外线照射的HaCaT细胞乳酸脱氢酶释放水平的作用消失;通过小分子核酸干扰技术敲低ATG5表达从而抑制自噬后,棉子糖干预减少中波紫外线照射的HaCaT细胞乳酸脱氢酶释放水平的作用消失。结论1、棉子糖能延缓中波紫外线照射后HaCaT细胞的死亡,但对凋亡的死亡方式无明显作用;2、棉子糖干预能促进HaCaT细胞的自噬流水平,也能提高中波紫外线损伤的HaCaT细胞的自噬流水平;3、棉子糖干预是通过非MTOR依赖的通路信号介导发生自噬;4、自噬信号途径参与了棉子糖延缓中波紫外线诱导的HaCaT细胞死亡。总之,棉子糖通过非MTOR依赖的自噬通路调控对皮肤紫外线损伤的保护作用。