脓毒症脾细胞损伤机制的探讨及丹参保护作用的实验研究

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目的复制脓毒症大鼠模型,动态观察脓毒症对脾组织细胞的影响;观察肿瘤坏死因子(TNF-a)和氧自由基(OFR)含量的变化对脾细胞凋亡的影响,以探讨脓毒症脾细胞凋亡的机制;观察中药丹参对此过程的干预作用,以期为脓毒症的临床治疗提供实验依据。方法选用体重180-250g的雄性Wistar大鼠96只,随机分为对照组(control group,Control)、假手术组(sham operated group,Sham)、模型组(cecal ligation and puncture group,CLP)和丹参干预组(salvia miltiorrhizatreated group,Salvia),每组24只。每组又分6h、12h、24h和48h四个时间点,每时间点6只。Control组动物仅给3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉;Shma组仅行盲肠翻动,不行结扎和穿刺;CLP组行盲肠结扎后用20号针贯穿盲肠3次制成脓毒症模型;Salvia组于行CLP后腹腔注射丹参注射液10g(1.0g/ml)。每组动物均于相应时间点麻醉活杀,腹主动脉取血,用于检测血清中TNF-a、MDA水平变化及GXH-Px活力测定。同时取其脾脏,分别用于脾组织匀浆的制备和病理组织学检查。采用双抗夹心ABC-ELISA法测定TNF-a,采用硫代巴比妥酸法测定MDA、采用DTNB直接法测定GSH-Px、采用终末脱氧核糖核酸转移酶介导的原位缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediateddUTP nick end labeling,TUNEL)技术检测脾细胞凋亡情况。采用多元性回归分析筛选影响脾细胞凋亡的因素。结果(1)脓毒症模型的确认:CLP组腹腔炎症的严重程度与时间呈依赖关系,腹腔炎症在48h达到高峰,腹腔内有大量脓性或血性渗出液,而Control组与Sham组腹腔无明显的炎症过程。(2)血清和脾组织TNF-a的变化与Control组相比,Sham组TNF-a水平在各时间点均增高(p<0.01),并且在12时间点达到峰值,其后逐渐下降。CLP组与Sham组相比,血清TNF-a水平在6h升高,于24h达到峰值。Salvia组也在6h升高,但峰值滞后于CLP组,于48h达到其峰值,并在24h显著低于CLP组(p<0.01)。(3)血清和脾组织MDA的变化Control组和Sham组MDA水平未见明显差异,与Sham组相比,CLP组在6h时间点明显增高,于48h达到峰值。Salvia组血清MDA增高滞后于CLP组,在12h后开始增高,在48h达到峰值,并在12h和24h分别显著低于同时间点CLP组(p<0.01)。(4)血清脾组织GSH-Px的变化Control组和Sham组血清GSH-Px未见明显变化,与Sham组相比,CLP组在6h降低,48h达到最低值。Salvia组GSH-Px降低滞后于CLP组,在12h后降低,也在48h达其最低值,水平接近于CLP组。Salvia组血清GSH-Px在6h、12h和24h三个时间点显著高于CLP组,(p<0.01),(5)脾细胞凋亡的变化CLP组在6h时间点阳性率增加,在24h达到高峰,在48h时间点阳性率减少。Salvia组在6h阳性率开始增高,24h达到高峰,但其阳性率在12h和24h低于同时间点CLP组(p<0.01)。(6)多元性回归分析结果:影响脓毒症大鼠脾细胞的凋亡的因素是血清MDA,脾组织MDA,脾组织TNF-a和脾组织GSH-Px。结论1.予Wistar大鼠施盲肠结扎穿孔术,成功地建立了大鼠脓毒症模型,可用于实验观察。2.脓毒症可致多器官功能障碍,脾脏即其靶器官之一,脾细胞凋亡是其损伤后的主要变化,而脓毒症引起的TNF-a含量增多及氧自由基代谢紊乱在其发生机制中起了重要作用。3.丹参可降低机体的TNF-a水平,调节自由基代谢,对脓毒症发病过程中脾组织起保护性作用,预防脾淋巴细胞过度凋亡引起的免疫抑制。
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