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目的化疗是迄今为止治疗恶性肿瘤最行之有效的方法之一,然而恶性肿瘤的治疗并不容乐观,因为瘤细胞会在治疗过程中产生耐药,从而导致肿瘤复发、转移。阿霉素是最具有代表性的抗肿瘤药物之一,克服肿瘤阿霉素耐药将会为解决肿瘤多药耐药(MDR)带来重大突破。因此,急需找到一种新的制剂来克服阿霉素耐药。许多研究表明肿瘤代谢与正常组织细胞代谢有所不同,抑制肿瘤的某一代谢途径是否能对肿瘤阿霉素耐药起到逆转作用呢?本课题以乳腺癌耐药细胞系MCF7/ADR为基本模型,研究肿瘤代谢过程中的关键酶的抑制剂是否能逆转阿霉素耐药,并对其逆转机制进行初步研究。方法1.利用测细胞内ATP值的方法分别测得乳腺癌化疗敏感细胞系MCF-7及化疗药耐药细胞系MCF-7/ADR接受不同浓度阿霉素作用后的ATP值,并计算出其IC50值进行比较。2.脂肪酸代谢关键酶抑制剂(Cerulenin、Orlistat)、谷氨酰胺酶抑制剂(Compound968)以及多种代谢酶的抑制剂—表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR,通过测ATP找到各种抑制剂的合适浓度与阿霉素联用,检测是否有肿瘤代谢抑制剂能逆转阿霉素耐药。3.利用测细胞ATP方法分别测得乳腺癌化疗敏感细胞系MCF-7及化疗药耐药细胞系MCF-7/ADR接受Compound 968不同浓度作用48小时后的ATP值。4.用ADR 5ug、Compound 968 10u M单独或联合作用于MCF7和MCF7/ADR细胞48小时,分别测其ATP值。5.用ADR 5ug、Compound 968 10u M单独或联合作用于MCF7和MCF7/ADR细胞,分别测得0h、12h、24h、36h、48h、60h的ATP值,以验证Compound 968逆转阿霉素耐药是否具有时间依赖性。6.两药联合作用于MCF7/ADR细胞:固定ADR、Compound 968其中一药浓度,逐渐增加另一药浓度,验证Compound 968逆转阿霉素耐药是否具有药物浓度依赖性。7.分别用含谷氨酰胺和不含谷氨酰胺的培养液培养MCF7和MCF7/ADR细胞,在day0、day1、day2、day3、day4、day5分别测其ATP值进行比较,验证在两种细胞中剥夺谷氨酰胺是否会起到与加入Compound 968一样的作用。8.在给予MCF7/ADR细胞ADR(5ug/ml)+Compound 968(20u M)的基础上,加入5m M谷氨酸、α-酮戊二酸、丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸或天冬酰胺等三羧酸循环代谢中间产物,48h后测ATP,检测是否能起到营救作用。9.构建降表达谷氨酰胺酶的质粒,构建稳定表达sh GLS的MCF7/ADR细胞系,通过Western blot加以验证,在此细胞系中加入ADR 5ug,48h后测ATP与对照细胞相比,分析是否降表达谷氨酰胺酶能逆转阿霉素耐药。结果1.48小时MCF-7/ADR阿霉素的IC50值约是MCF7的300倍。2.谷氨酰胺酶抑制剂(Compound 968)能够逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药。3.Compound 968对MCF7和MCF7/ADR两种细胞的生长均有抑制作用,且在10-80u M浓度范围内加大用药浓度基本不会增加药效。4.Compound 968能够逆转MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药,且此作用具有时间及药物浓度依赖性;但在MCF7细胞中两药联合未见协同作用。5.MCF7和MCF7/ADR两种细胞生长均具有谷氨酰胺依赖性。6.谷氨酸和丙酮酸能对ADR、Compound 968联合作用于MCF-7/ADR细胞起到一定的营救作用。7.降表达谷氨酰胺酶能逆转MCF7/ADR细胞阿霉素耐药。结论肿瘤细胞内存在异常的谷氨酰胺代谢,谷氨酰胺分解代谢除了为快速增殖的肿瘤细胞提供营养和能量外,还应具备其他的生物学功能。结果证实,谷氨酰胺代谢平衡是乳腺癌细胞快速生长所必需的。同时发现谷氨酰胺酶抑制剂compound 968能够逆转乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR阿霉素耐药,且此过程具有时间和药物浓度依赖性。对此过程的初步探究得出降低谷氨酰胺酶活性能逆转MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药,且谷氨酸和丙酮酸能对其起到一定的营救作用。