研究背景脑卒中,属于中医“中风病”范畴,具有三高(高发病率、高致残率、高致死率)特点。根据病因不同可分为缺血性与出血性,在我国以缺血性脑卒中为主,提高中风治疗与预防水平,降低“三高”是其当务之急,也是国内外研究的热点和难点。缺血性脑卒中病理过程是一个多因素、多环节、多途径损伤的酶促级联反应,其具有复杂的网络分子机制。中医认为,脑卒中之证有风、火、痰、瘀、虚之别,但瘀阻脑络是贯穿中风病始终的病理核心,故中医常用活血化瘀法治疗缺血性脑卒中。研究显示,活血化瘀方可改善缺血瀑布级联反应的初始即缺血区的血液供应,但在临床上缺血性脑卒中治疗目标不仅在于对缺血区血液供应的改善,同时也要阻断脑缺血后“瀑布级联反应”分子链。揭示活血化瘀方在脑缺血瀑布级联反应中的作用及抗脑缺血分子网络机制,不仅有助于中医活血化瘀法科学内涵的阐释,亦为活血化瘀方在临床防治脑缺血提供了理论依据。基于此,本研究以活血化瘀代表方-丹红方(丹红注射液)作为切入点,从脑缺血病理反应不同环节结合蛋白质及代谢组学技术,综合阐释丹红注射液抗脑缺血的作用特点及相关机制,以期从分子层面阐释活血化瘀方防治脑缺血作用机理。该研究方向获得了国家自然基金重点项目的资助(No.81330086),本课题属于该项目的研究内容之一。研究内容本研究分为两个方面,文献综述与实验研究。文献综述:系统回顾了脑缺血病理机制及与其相关信号转导通路,并对丹红注射液临床疗效、药理作用及其相关机制进行了梳理,以期为后期实验研究提供方向和参考。实验研究:本研究在对丹参、红花药对配伍特点以及丹红注射液抗脑缺血“量-效”,“时-效”研究的基础上,从脑缺血病理过程中相关环节考察丹红注射液抗脑缺血的作用,并采用组学技术,从蛋白质及氨基酸代谢层面,综合阐释丹红注射液抗脑缺血作用机理,以期为脑缺血现代研究及活血化瘀方防治脑缺血提供深层次认识。实验内容共包括三个部分:1.基于数据挖掘的丹参、红花药对配伍特点研究:基于《中医方剂大辞典》及《中药成方制剂》数据库,应用“中医传承辅助平台”系统,提取含丹参、红花药对的方剂,运用软件的关联规则,改进的互信息法等数据挖掘方法,客观地分析丹参、红花药对的组方规律和特点,以期更好地理解丹红注射液配伍的原理和适应证,为后续相关实验研究提供理论支持。2.基于脑缺血病理反应相关环节的丹红注射液抗脑缺血作用研究:通过不同剂量丹红注射液干预大鼠脑缺血模型,在筛选出最佳剂量的基础上,观察丹红注射液对12h、24h脑缺血的干预作用,并从神经元凋亡及血脑屏障方面考察丹红注射液在脑缺血病理级联反应中不同环节的保护作用,从而初步明确丹红注射液抗脑缺血的作用特点,为后期机制研究奠定基础。3.基于组学技术的丹红注射液抗脑缺血作用机制研究:在明确丹红注射液对脑缺血不同环节具有保护作用的基础上,利用蛋白质组学技术,考察丹红注射液对脑缺血状态下海马组织中蛋白质谱的影响,通过数据分析和挖掘,筛选出具有特征变化的相关蛋白以及这些蛋白可能富集到的通路,并对相关蛋白质进行验证;同时利用靶标代谢组学技术,进一步考察了其对脑缺血状态下大脑皮层相关氨基酸代谢变化情况,进而从不同层面综合阐释丹红注射液对脑缺血的保护作用机制。实验结果1.基于数据挖掘的丹参、红花药对配伍特点研究结果共纳入方剂39首、中成药74种,其中发现丹参、红花常与活血、行气之品联用,且绝大部分药物归心、肝经,主以胸痹、真心痛、心悸、中风、瘀血疼痛证、妇科病等为治疗病证。2.基于脑缺血病理反应相关环节的丹红注射液抗脑缺血作用特点研究(1)丹红注射液抗脑缺血量-效、时-效研究不同剂量(1.44、0.72、0.36、0.18mL/kg)丹红注射液干预脑缺血模型大鼠,以0.72mL/kg效果最佳,且0.72 mL/kg、0.36 mL/kg、0.18 mL/kg剂量之间呈现量效关系,0.72mL/kg丹红注射液抗脑缺血作用24h疗效优于12h。(2)丹红注射液对脑缺血大鼠血脑屏障通透性的影响丹红注射液除可改善脑缺血大鼠神经功能评分、脑梗死体积外,还可以减轻脑水肿和血脑屏障崩解程度,并对脑缺血状态下脑组织、心肌组织中的α-actinin蛋白含量均有调整作用,提示α-actinin蛋白变化可能是丹红注射液治疗脑病、心病的共同分子生物学基础之一。(3)丹红注射液对脑缺血大鼠神经凋亡的影响脑缺血后大鼠海马组织表现出神经细胞凋亡,缺血诱导了 Apaf-1及其下游分子Caspase-9、Caspase-3的表达,并且增加Bax表达,降低Bcl-2的表达,从而降低Bcl-2/Bax比值;丹红注射液可显著抑制Apaf-1及Caspase-9、Caspase-3的激活,逆转Bax、Bcl-2蛋白表达以及Bcl-2/Bax比值的变化。提示丹红注射液可通过抑制脑缺血大鼠海马组织Apaf-1的表达,从而抑制Caspase信号通路活性来发挥抗凋亡的作用,使Caspase介导的缺血核心周边半暗带细胞凋亡扩展减慢。3.基于组学技术的丹红注射液抗脑缺血作用机制研究(1)基于靶标代谢组学的丹红注射液抗脑缺血作用研究研究显示:脑缺血大鼠供能氨基酸(Val、Ile、Leu、Lys)和神经递质类氨基酸(Gln、Glu、Gly、Ser、Tau、Tyr、Phe)变化显著,丹红注射液可选择性调节脑中供能氨基酸的异常,降低Glu含量,并抑制Gln、Gly、Ser对其兴奋毒性的放大。提示丹红注射液可通过改善脑能量代谢和神经递质氨基酸的释放/合成,进而发挥脑保护作用。(2)基于蛋白质组学的丹红注射液抗脑缺血作用机制研究以蛋白质组学为研究手段,发现与丹红注射液抗脑缺血作用显著相关的蛋白有12个(Gsk-3β、Cnsklg1、Gpc4、Ctbp2、Acta2、Apc、Akt1、Sos1、Prkaa1、Eef2、Flnc、Rap1a),主要富集于WNT信号通路、AMPK信号通路以及MAPK信号通路,并对其蛋白质相互作用网络关系进行分析,获得以Gsk-3β和Akt1为中心节点的与其它潜在靶标蛋白共同组成的蛋白网络,结合验证实验发现除Ctbp2外其余11个蛋白质免疫印迹结果与质谱结果表达趋势一致,且Gsk-3β蛋白抑制剂阻断实验亦证实了丹红注射液参与了候选蛋白质在脑缺血损伤海马组织中的表达变化。综上所述,通过本研究初步揭示了丹红注射液抗脑缺血的作用特点、蛋白网络、相关信号通路以及氨基酸代谢情况,从而系统阐释活血化瘀方(丹红注射液)抗脑缺血的作用及其机制;另外,所获得的蛋白网络可能是脑缺血病理机制的核心单元,进而为认识和防治脑缺血提供参考和依据。本研究创新点1.揭示了丹红注射液抗脑缺血作用与改善能量代谢、神经递质氨基酸的释放/合成,抑制神经元凋亡以及保护血脑屏障有关;2.揭示了丹红注射液抗脑缺血作用相关的由12个蛋白组成的网络,涉及三条信号通路,即WNT信号通路、AMPK信号通路和MAPK信号通路。