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小麦条锈病是由条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.Tritici)引起的最严重的小麦病害之一,是世界范围内公认的影响冬季谷物生产的主要病害。条锈菌可以借助风力远距离传播,小麦条锈病在中国的危害范围很大,培育抗性品种是预防和控制条锈病最有效的途径。Yr26是从由南京农业大学细胞遗传所培育出的普通小麦-簇毛麦易位系材料中挖掘出的抗条锈病基因,该基因对目前中国所有的条锈菌优势小种均有抗性。王春梅等(2008)将Yr26定位于小麦1B染色体片段C-1BL-6-0.32,Zhang(2013)等通过高密度遗传图谱的构建,将Yr26定位到CON4和CON6两个分子标记之间,它们和Yr26之间的遗传距离分别为0.08cM和0.17cM。由于Yr26定位在染色体近着丝粒区域,这给图位克隆带来了很大难度。本研究尝试综合利用基因芯片和精细定位的信息,筛选Yr26抗病相关基因和候选基因。1、基于多样本、多时间段的基因芯片高通量筛选和病毒介导基因沉默功能快速鉴定体系发掘条锈病抗性相关基因本实验室利用基因芯片技术,获得感病材料扬麦158、抗病材料92R137和抗病材料R236受条锈菌诱导前和诱导后12小时和36小时的基因表达谱。对差异表达基因进行分析,获得17个特异性地在抗病材料中受条锈菌诱导表达的基因,这17个基因不仅在两个抗病样本中均受条锈菌诱导表达,而且在两个抗病材料与感病材料受条锈菌诱导12小时和36小时两个时间段相比也呈现差异表达趋势。对17个差异探针进行了功能注释,从中筛选出可能与抗病相关的3个基因Ta.23165.1.S1_at、Ta.16040.1.A1_at、TaAffx.114048.1.S1_at。Ta.23165.1.S1_at 编码 SNF1 型丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,Ta.16040.1.A1_at 编码 GTP 结合蛋白 OBGC1,TaAffx.1 14048.1.S1_at(HP)编码热击蛋白。利用VIGS技术对这3个基因进行初步功能分析,结果表明:与对照相比基因沉默植株叶片表型没有明显差异,但组织学观察显示目的片段沉默后导致条锈菌侵染点坏死面积减小、次生菌丝分支数增加、菌丝长度增长,推测这些基因可能在Yr26抗条锈病的过程中发挥一定作用。2、基于基因精细遗传定位和差异表达数据筛选Yr26的候选基因在受条锈菌诱导12小时,抗病材料R236和92R137与感病材料扬麦158相比有278个差异表达基因;在受条锈菌诱导36小时,抗病材料R236和92R137与感病材料扬麦158相比有299个差异表达基因;抗病材料R236和92R137诱导12小时与非诱导样本相比有1884个差异表达基因;抗病材料R236和92R137诱导36小时与非诱导样本相比有3296个差异表达基因。将4个数据库中的5757个差异表达探针序列与D基因组序列相比,发现有443个探针在1D染色体上有同源基因,其中120个位于Yr26两侧标记CON4和CON12的覆盖区间内。继续对这120个基因在IWGSC的1BL测序数据库中进行同源性分析,发现其中17个基因在1BL上有同源基因。对这17个基因进行功能预测,发现有参与细胞组成的基因,转录因子基因和抗病蛋白基因等。3、Yr26候选基因TaRLP2的克隆与特征分析在上述筛选到的17个基因中发现了编码LRR类受体蛋白的基因Ta.4479.2.S1_a_at。生物信息学分析获得了 Ta.4479.2.S1_a_at 在 1AL,1BL 和 1DL 上的同源序列,设计了针对三个基因的保守引物和针对1BL序列的特异引物。在含有Yr26基因的抗条锈病材料[92R137、PR(以92R137为供体亲本、扬麦158为轮回亲本的回交8代群体中筛选出的抗条锈病材料)、Yr26的来源亲本γ-80]和感条锈病材料[扬麦158、感条锈病材料PS(以92R137为供体亲本、扬麦158为轮回亲本,在回交8代群体中筛选出的感条锈病材料)、四倍体感条锈病材料中引1286]中进行保守引物的首轮PCR和B组特异引物的巢式PCR扩增,克隆得到各个抗感材料中位于1BL染色体上的1368bp的基因。将从抗感材料中克隆得到的基因序列进行多序列比对,发现抗病材料来源的基因和感病材料来源的基因序列同源性很高,仅在几个位点上存在SNP的差异,并且这些SNP位点在抗病材料中是一致的,感病材料中是一致的:在31,255,270位核苷酸由感病材料的C突变为抗病材料的T,62位由感病材料的G变为抗病材料的C,120位由感病材料的A变为抗病材料的C,279位由感病材料的G变为抗病材料的T。对B组基因序列进行蛋白结构预测,发现该基因编码LRR类受体蛋白,因此将该基因命名为TaRLP2。通过对抗感材料TaRLP2氨基酸序列分析发现,发现两者之间只有两个氨基酸位点存在差异,其中在第16位感病来源的基因是疏水性的脯氨酸(P),抗病来源的基因为亲水性丝氨酸(S),在第26位感病来源的基因是亲水甘氛酸(G),而抗病来源的基因为疏水性的丙氛酸(A)。抗感材料中氨基酸差异位点位于基因的信号肽区域,有研究表明信号肽引导分泌蛋白质的运输,因此推测该基因信号肽区域氛基酸序列的突变可能导致其在抗感材料中行使不同的功能。本研究在利用基因芯片高通量筛选获得一批受条锈菌诱导差异表达基因的基础上,利用病毒诱导基因沉默技术对部分基因进行了初步功能分析,同时基于精细定位信息和生物信息学分析克隆了Yr26的候选基因,推动了Yr26基因的克隆和功能鉴定研究。