疼痛是临床上常见的症状,常给病人带来极大的痛苦。有关痛觉过敏的发生机制,目前普遍认为主要是由于外周伤害性信息持续传入,导致初级神经末梢释放大量的神经递质,这些递质作用于脊髓后角次级神经元上相应受体,激活细胞内信号转导过程,引起一氧化氮(nitric oxide, NO)产生增加以及蛋白激酶C(protein kinase, PKC)激活,二者可通过复杂的机制引起痛感受和痛觉过敏。我室曾静波[1,2]的研究发现,大鼠右后掌注射甲醛后能引起脊髓后角神经元一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)活性升高及NO产生增多。我室胡玉燕[3]近期的研究结果显示,甲醛炎性痛可以诱导大鼠海马神经元凋亡,侧脑室注射NMDA受体拮抗剂MK-801可抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠海马神经元凋亡及凋亡相关基因的表达,提示,中枢内兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs)释放及其受体的激活参与了伤害性信息传入对大鼠海马神经元凋亡的诱导。伤害性信息传入到脊髓引起的大量递质释放及其受体的过度激活是否也会引起脊髓神经元凋亡,在此过程NO生成增多是否在神经元凋亡中发挥作用,目前尚未见相关文献报道。因此,本实验观察了大鼠甲醛炎性痛时脊髓后角神经元凋亡的改变,并观察了这一改变的时间特征。在此基础上,进一步观察了一氧化氮在甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓后角神经元凋亡中的作用。1甲醛炎性痛致大鼠脊髓神经元凋亡方法健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,体重280±20克,随机分为6组,分别为:对照组(control组),甲醛1d组(F 1d组),甲醛2d组(F 2d组),甲醛3 d组(F 3d组),甲醛4d组(F 4d组),甲醛7d组(F 7d组),每组5只动物。对照组不加任何处理,直接断头取材。足底注射甲醛1d、2d、3d、4d、7d组分别于大鼠右侧足底注射0.2 ml 5%甲醛溶液致外周炎性痛后,立即计数1h内每5 min大鼠自发缩足次数,于相应时间点断头取材,采用流式细胞技术检测L4～5脊髓节段神经元的凋亡率。结果结果发现,足底注射甲醛可诱导大鼠产生一个双相的自发痛反应,表现为嘶叫、自发性缩足,舔咬患爪等。大鼠第一时相痛反应在足底注射甲醛后立即出现,持续5~10 min;经过短暂间歇期(约5 min)出现第二时相疼痛反应,可持续40 min以上。正常对照组大鼠L4～5脊髓节段神经元的凋亡率很低,与对照组相比,足底注射甲醛后1d时,神经元凋亡率即明显增加(P<0.05),3d时神经元凋亡率达高峰,注射甲醛后4d,大鼠L4～5脊髓节段神经元凋亡率有所降低,但仍高于对照组水平(P<0.05),7d时神经元凋亡率基本恢复至正常水平。结论结果表明,甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓神经元凋亡的发生,注射甲醛后3d凋亡达高峰,7d时基本恢复至正常水平。2 NO在甲醛炎性痛诱导大鼠脊髓后角神经元凋亡中的作用方法健康雄性Sprague-Dawley大鼠70只,体重280±20克,随机分为7组,分别为正常对照组,鞘内注射L-精氨酸组(L-Arg组),甲醛组(F组),甲醛+鞘内注射生理盐水组(F+NS组),甲醛+鞘内注射L-NAME 0.5μmol组(F+L-NAME 0.5μmol组)、甲醛+鞘内注射L-NAME 2μmol组(F+L-NAME 2μmol组)及甲醛+鞘内注射L-NAME 4μmol组(F+L-NAME 4μmol组)。各组均为10只动物,其中5只用于脊髓神经元凋亡率变化的观察,5只用于观察脊髓后角神经元p53蛋白的表达。正常对照组不加任何处理,直接断头取材; L-Arg组动物鞘内注射10μl L-Arg溶液(含4.7μmol L-Arg)后首先计数1h内缩足次数,12h时直接断头取材;甲醛+ NS组( F+NS )、甲醛+ L-NAME 0.5μmol组( F+L-NAME 0.5μmol )、甲醛+ L-NAME 2μmol组(F+L-NAME 2μmol)和甲醛+ L-NAME 4μmol组(F+L- NAME 4μmol)动物,于注射甲醛前分别鞘内注射10μl NS溶液和10μl L-NAME溶液(分别含0.5μmol、2μmol、4μmol L-NAME),于注射甲醛后,首先计数1 hour内缩足次数,然后于注射甲醛后3d断头取材。采用流式细胞技术检测脊髓神经元凋亡率,应用免疫组织化学方法观察脊髓后角神经元p53蛋白的表达。结果结果发现:鞘内注射L-Arg溶液后,动物出现了嘶叫,烦躁不安,易激惹现象,表明动物出现了伤害性反应。动物足低注射甲醛后立即出现嘶叫,缩足,舔咬注射部位等自发痛反应行为。F组与F+NS两组之间相比,第一相和第二相每5分钟的缩足次数均无显著性差异。甲醛+不同剂量L-NAME(0.5μmol、2μmol、4μmol)组动物鞘内注射L-NAME后,可剂量依赖性抑制甲醛诱导的伤害性反应,表现为第一、二相自发缩足次数显著降低(P<0.01)。L-Arg组脊髓神经元凋亡率高于对照组水平。F组及F+NS组脊髓神经元凋亡率均明显高于对照组(P<0.05),但两组之间无显著性差异。与F+NS组相比,F+ L-NAME 0.5μmol组、F+L-NAME 2μmol和F+L-NAME 4μmol组L4～5脊髓节段神经元的凋亡率均明显降低,L-NAME剂量越大,神经元的凋亡率降低越显著。Control组大鼠L4～5脊髓后角可见少量散在的p53免疫反应阳性细胞,p53免疫反应阳性细胞胞体多为椭圆形或不规则三角形,周围有明显的突起和纤维,符合神经元特征。这些细胞染色较浅,左右两侧无明显差异;与control组相比,L-Arg组脊髓后角神经元Ⅰ~Ⅱ板层p53免疫反应阳性细胞数目明显增加,染色加深;与control组相比,F组及F+NS组大鼠注射侧脊髓后角神经元Ⅰ~Ⅱ板层、Ⅲ~Ⅵ板层p53阳性细胞数量明显增加(P<0.05),染色明显加深,即灰度值明显降低(P<0.05),注射同侧脊髓后角内p53阳性细胞数量及染色深度均高于对侧(P<0.05),相同侧相比,两组之间无显著性差异。与F+NS组相比,甲醛+L-NAME各剂量组脊髓后角神经元p53阳性细胞数量和阳性细胞染色深度均明显降低,L-NAME的剂量越大,其阳性细胞的数量及染色深度的降低程度越明显。以上结果表明,鞘内注射L-Arg可使正常大鼠出现自发痛反应,可引起大鼠脊髓后角神经元p53蛋白表达增加并诱导神经元凋亡;预先鞘内注射L-NAME,可剂量依赖性抑制甲醛炎性痛诱导的大鼠脊髓神经元凋亡及脊髓后角神经元p53蛋白的表达,提示炎性痛时脊髓后角NOS的活性增强以及NO生成过多参与了神经元凋亡的诱导过程。本实验还证实,促进p53蛋白表达可能是NO诱导脊髓后角神经元凋亡的重要环节之一。结论甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓神经元凋亡,注射甲醛后3d神经元凋亡达高峰。炎性痛时脊髓后角NO产生增多参与了神经元凋亡的诱导过程。促进p53蛋白表达可能是NO诱导脊髓后角神经元凋亡的重要环节之一。