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免疫分析是生化分析中最重要的方法之一,在生物医学研究和临床检验中都有着广泛的应用。然而通量低、耗时长、操作过程复杂等缺陷限制了常规免疫分析手段在现场检测、基因组学、蛋白组学以及重大疾病的大规模筛查等需要实时、快速检测场合的应用。
液相芯片技术是用于免疫分析技术发展的一个里程碑。它的出现,使几十甚至上百种物质同时在线检测成为了可能。而且检测在液相中进行,可以最大限度的模拟抗原抗体生理环境下结合的情景,维持抗原抗体的活性且动力学过程与自然环境下相似。然而现有液相芯片技术因为标记和报告分子采用的都是有机荧光染料,存在着激发光背景噪声大、检测端荧光相互干扰,需要靠后续信号处理改善的问题,亟需一种新的技术来进一步提高灵敏度和准确度。
本文在分析现有液相芯片技术的基础上,提出了光-磁双标记技术以及梯度磁场下富集分离的预编码方式用于液相芯片的编码和定量,旨在为改进现有技术提供一种新的可能,并通过实验及仿真结果可以为新型液相芯片的设计提供一些依据。
超顺磁性氧化铁和量子点都是良好的免疫分析载体。前者的磁化强度与磁场的强度以及自身的粒径成正相关,相同材料不同大小的磁珠磁化强度具有明显差异,可以在磁场的作用下分离;后者具有明亮的荧光,激发光谱宽,且连续分布,同时发射光谱具有窄而对称的特性,也非常适合与生物分子偶联。因此,分别用磁性探针和荧光探针结合形成磁珠-抗体-抗原-抗体-量子点免疫复合物,再用磁性探针作为编码,荧光探针作为定量工具,可以有效地改善单纯荧光编码和定量带来的干扰问题。不同颜色的量子点采用同样波长的激光激发,也解决了激发光源背景噪声大的问题。
本文通过正交实验分析了温度、葡聚糖与铁盐、氨水用量用量对形成的葡聚糖包被纳米磁珠粒径的影响:通过控制实验条件来制备粒径分布在30-300nm范围的纳米磁珠,运用透射电子显徼镜、红外光谱、激光散射动态粒径仪等技术对磁珠的物理和化学性质进行了表征。并采用高碘酸钠氧化的方法,将葡聚糖上的羟基氧化为醛基,实现了与单克隆抗体偶联制备磁性探针的设想。在此基础上我们还采用免疫层析的方法证明了磁性探针中的抗体保持了良好的生物活性。
采用水热法在温和的条件下直接在水相中制备了发射波长在550-650nm的巯基丙酸包被CdTe量子点,并通过投射电子显微镜、荧光光谱、紫外-可见光谱等方法分析了量子点的形态和光学特性。采用碳二亚胺法活化量子点表面羧基,实现了量子点与单克隆抗体的偶联,并采用酶联免疫吸附实验定量说明了磁性探针中的抗体生物活性几乎没有损伤。
此外,我们还采用计算流体力学仿真的方法对梯度磁场下磁性探针标记的免疫复合物分离做了模拟。分别从质量守恒、动量守恒、磁场中受力的角度对体系建立了数学模型,并采用有限体积法离散方程,用FLUENT软件对模型进行了数值求解。结果表明,磁性纳米颗粒对磁场有着快速的响应,与载体相互作用会使局部载液分子流速增快;颗粒本身受磁力的作用会偏离流线,与管壁碰撞,又快速的返回载液。仿真结果给基于纳米磁珠的新型液相芯片的设计制造提供了重要理论参考。