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鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium，S.Typhimurium)是引起人与动物沙门氏菌病的主要血清型，导致人及畜禽的胃肠炎，及小鼠的伤寒样全身性感染。主要毒力因子包括黏附素、鞭毛、分泌系统、毒力质粒等。沙门氏菌外膜蛋白可诱导宿主巨噬细胞凋亡，协助细菌具有耐药性，并作为毒力因子在细菌的致病过程中发挥重要作用。Ⅱ型分泌系统(T2SS)是外膜蛋白输出的重要方式。而GspE是细菌T2SS的关键蛋白，可作为能量泵，为蛋白的分泌提供所需的能量，这些蛋白质通常是侵袭感染宿主所需的毒力因子，毒素或裂解酶。鉴于GspE的重要作用，本研究缺失S.TyphimuriumW32中gspE基因，利用蛋白质组学筛选细菌外膜蛋白差异表达蛋白，以期进一步发掘S.Typhimurium致病机制。 1、鼠伤寒沙门氏菌gspE基因突变株的构建及外膜蛋白蛋白组学分析 根据GenBank中发表的鼠伤寒沙门氏菌USDA-ARS-USMARC-1808gspE基因的全长序列(收录号:CP014969.1)，在其保守区设计鉴定引物，以S.TyphimuriumW32为模板，PCR扩增，获得W32菌株gspE基因序列。利用Red同源重组技术，成功构建突变株W32ΔgspE。并通过基因克隆技术成功构建回补株W32ΔgspE/pgspE。采用差速离心法提取鼠伤寒沙门氏菌野生株W32及缺失株W32ΔgspE的外膜蛋白，Bradford和SDS-PAGE鉴定所提蛋白质量。iTRAQ技术定量蛋白质，共鉴定到1444个蛋白（按照至少包含两个unique肽段过滤，共鉴定到1199个蛋白），其中存在显著差异的蛋白数为393个(W32-W32ΔgspE)(其中显著性差异蛋白质数目按照上调≥1.5或下调≤0.67，P≤0.05进行相应的筛选)，W32相比W32ΔgspE上调蛋白271个，下调蛋白122个。对所有鉴定蛋白和显著性差异蛋白质进行功能注释（包括GO、COG、Pathway分析），对显著性差异蛋白质进行表达量层次聚类分析以及功能富集分析(GO富集，Pathway富集)。结果发现gspE缺失株中多种与黏附、侵袭等致病途径相关的毒力蛋白的表达发生变化，为进一步研究S.Typhimurium毒力相关机制提供依据。 2、鼠伤寒沙门氏菌gspE基因相关特性及毒力研究 在研究一的基础上，通过生长试验、生物被膜定性定量试验、泳动性试验、DF1细胞黏附试验、HD11细胞侵袭试验、荧光定量PCR试验，探究gspE基因对S.Typhimurium致病性的影响。结果表明，缺失株生物被膜形成能力减弱，相比野生株下调30％(P＜0.05)，差异显著。对DF1细胞的黏附能力减弱，相比野生株下调明显，差异极显著(P＜0.01)。对HD11细胞的侵袭能力减弱，相比野生株下调90％(P＜0.01)，差异极显著。泳动性试验中，缺失株W32ΔgspE运动能力稍许上调。随后，在转录水平上对野生株W32、缺失株W32ΔgspE和回补株W32ΔgspE/pgspE部分基因的表达水平进行检测，以沙门氏菌gyrA为内参，通过qRT-PCR检测sefA基因(sef21菌毛主要亚单位)，fimA基因（Ⅰ型菌毛主要亚单位），agfA基因（凝集性菌毛主要亚单位），fliC基因（鞭毛主要亚单位），cpxR基因（双组份信号转导系统），phoP基因（双组份组分系统），cobB基因（沙门氏菌酸抗相关）。结果发现，相对野生株W32，缺失株W32ΔgspE中fimA、sefA、agfA、cobB基因的表达全部上调，而fliC、phoP和cpxR基因表达下调。fimA、phoP、cpxR基因在缺失株中的表达情况与蛋白质组学结果一致。综上所述，GspE蛋白能调控S.TyphimuriumW32中双组份调控系统有关基因、菌毛相关基因及相关蛋白的表达影响其黏附、侵袭能力，进而调控S.Typhimurium致病性。