研究目的对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP),是临床常用的解热镇痛类非处方药。过量服用APAP会诱发严重的急性肝损伤,是发生急性肝衰竭的最常见诱因。以前的研究证实线粒体是APAP肝毒性的关键靶点。线粒体功能障碍不仅能诱导氧化应激导致肝损伤,还可以通过激活炎症小体介导的炎症反应进一步加重肝损伤。自噬作为真核细胞内高度保守的蛋白降解机制,可以将错误折叠的蛋白质及受损的细胞器输送至溶酶体进行降解。研究发现自噬参与了许多疾病发生与发展的病理生理过程,然而到目前为止,国内外关于自噬与APAP肝毒性的研究才刚刚起步。现有研究仅仅提示自噬作为一种细胞应激机制,很可能在APAP诱导的急性肝损伤中起重要作用。但由于以往的研究没有系统检测APAP诱导肝损伤过程中自噬的动态变化,也未对自噬的作用及可能的作用机制进行深入探讨。因此,自噬与APAP肝毒性二者关系中的一些关键问题还没有解决。本研究通过建立APAP急性肝损伤动物模型和自噬干预动物模型,研究APAP染毒后小鼠肝脏中自噬变化的特点和规律,特别是Pink1-Parkin介导的线粒体自噬途径的变化,以及对NLRP3炎性小体活化、炎症介质释放的影响,以此阐明自噬在APAP肝毒性中的可能作用机制。研究方法1.APAP诱导小鼠急性肝损伤模型和自噬干预模型的建立(1)剂量-反应模型:40只雄性C57BL/6小鼠适应性喂养3天后,随机分为4组:对照组,APAP低剂量组(180mg/kg.bw)、中剂量组(300mg/kg.bw)和高剂量组(500mg/kg.bw)。禁食12h后,染毒组小鼠腹腔注射APAP溶液,对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,24h后摘眼球取血,处死小鼠并取肝脏组织。(2)时间-反应模型:设对照组,APAP3h、6h、12h、24h和48h组,每组10只小鼠。禁食12h后,染毒小鼠腹腔注射300mg/kg.bw APAP溶液后分别于3、6、12、24及48h摘眼球取血,处死小鼠并取肝脏组织。(3)自噬干预模型:一是雷帕霉素(rapamycin,RAPA)干预模型,设8个分组:对照组、2mg/kg.bwRAPA 组、4mg/kg.bwRAPA 组、8mg/kg.bwRAPA 组、300mg/kg.bw APAP 模型组、2mg/kg.bw RAPA + 300mg/kg.bw APAP 组、4mg/kg.bw RAPA+ 300mg/kg.bw APAP 组及 8mg/kg.bw RAPA+ 300mg/kg.bw APAP组,每组10只小鼠。禁食12h后,对照组给生理盐水,RAPA组分别以2mg/kg.bw、4mg/kg.bw、8mg/kg.bw 剂量腹腔注射 RAPA 溶液,APAP 模型组腹腔注射300mg/kg.bw APAP溶液,RAPA干预组提前lh分别先以2mg/kg.bw、4mg/kg.bw、8mg/kg.bw 剂量腹腔注射 RAPA 溶液后给予 300mg/kg.bw APAP,24h后摘眼球取血和肝脏组织。二是氯喹(chloroquine,CQ)干预模型,设4个分组:对照组、60mg/kg.bw CQ 组、300mg/kg.bw APAP 组及 60mg/kg.bw CQ+300mg/kg.bwAPAP组,每组10只小鼠。禁食12h后,对照组给生理盐水,CQ组以60mg/kg.bw剂量腹腔注射CQ溶液,APAP模型组腹腔注射300mg/kg.bw APAP溶液,CQ干预组提前1h腹腔注射CQ溶液后给予300mg/kg.bw APAP,24h后摘眼球取血和肝脏组织。2.生化指标、肝胧脏病理、蛋白及基因表达水平的检测(1)小鼠均取血清测ALT、AST生化指标,剥离肝脏称重并计算肝脏系数,取肝脏同一位置做病理切片,HE染色检测病理损伤。(2)剂量-反应模型及时间-反应模型小鼠,匀浆肝脏组织分别提取总蛋白、线粒体蛋白和核蛋白,利用Western Blot检测自噬、线粒体自噬、炎症及p62-Keapl-Nrf2通路相关蛋白的表达变化。匀浆肝脏组织提取总RNA,逆转录成cDNA,Real-Time PCR检测抗氧化基因的相对表达。(3)RAPA干预模型小鼠,匀浆肝脏组织分别提取总蛋白和线粒体蛋白,利用Western Blot检测自噬、线粒体自噬、炎症相关蛋白的表达变化。(4)CQ干预模型小鼠,匀浆肝脏组织提取总蛋白,Western Blot检测炎症相关蛋白的表达变化。研究结果1.APAP诱导小鼠急性肝损伤中自噬及线粒体自噬变化(1)APAP诱导小鼠急性肝损伤的剂量-反应关系:与对照组相比,APAP染毒小鼠肝脏系数和血清ALT、AST水平显著升高,呈明显的剂量反应关系;小鼠肝脏组织出现炎性细胞浸润、胞质疏松呈空泡状等病理改变,且随剂量增加肝细胞坏死范围逐渐增大,肝损伤程度逐步加重。(2)APAP诱导小鼠急性肝损伤的时间-反应关系:与对照组相比,APAP染毒小鼠肝脏系数和血清ALT、AST水平随时间显著升高,24h时ALT、AST水平最高,48h明显下降;同时小鼠肝脏组织出现不同程度的肝细胞坏死,24h时肝细胞坏死程度最为严重,48h时有所恢复。(3)APAP染毒对炎症相关蛋白的影响:与对照组相比,APAP染毒引起小鼠肝脏中炎症相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β表达显著升高。(4)APAP染毒对自噬相关蛋白的影响:与对照组相比,APAP染毒后自噬相关蛋白p62、LC3-Ⅱ显著增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显增大,具有明显的剂量-反应关系和时间-反应关系。(5)APAP染毒对线粒体自噬相关蛋白的影响:与对照组相比,APAP染毒后线粒体提取组分中接头蛋白OPTN、NDP52、p62随剂量增加而显著增加,线粒体及胞浆中Parkin、Pink1蛋白也呈剂量依赖性和时间依赖性显著增加。2.APAP诱导小鼠急性肝损伤中p62-Keap1-Nrf2信号通路变化(1)p62-Keap1-Nrf2信号通路相关蛋白表达变化:与对照组相比,APAP染毒后p-TBK1、p62、p-p62表达显著增加,胞核及胞浆中Nrf2表达也明显增加,且胞核内Nrf2表达量在APAP染毒6h后与对照组相比有统计学差异。(2)抗氧化相关基因变化:在剂量-反应模型中,APAP染毒后与对照组相比,HO-1、GCLC表达明显下降,GSTA1表达增加;在时间-反应模型中,APAP染毒后HO-1、GCLC和GSTA1基因表达分别在3h、6h、24h达到最大值。3.自噬药物干预剂对线粒体自噬和炎症反应的影响(1)RAPA干预对APAP肝损伤的影响:与APAP模型组相比,RAPA干预后小鼠血清ALT、AST水平显著下降,且病理结果显示随干预剂量增加肝损伤程度逐渐减轻。(2)RAPA干预对自噬相关蛋白的影响:与APAP模型组相比,RAPA干预后自噬相关蛋白p62、p-p62表达下降,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显增大。(3)RAPA干预对线粒体自噬相关蛋白的影响:与对照组相比,APAP染毒后小鼠肝脏及线粒体提取组分中Parkin、Pink1、Drp1表达显著增加,Opa1表达降低;而RAPA干预后与APAP模型组相比,小鼠肝脏及线粒体中Parkin、Pink1、Drp1表达降低,Opa1表达增加。(4)RAPA干预对炎症相关蛋白的影响:与APAP模型组相比,RAPA干预后炎症相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β表达均显著降低。(5)CQ干预对炎症相关蛋白的影响:与APAP模型组相比,CQ干预后炎症相关蛋白NLRP3、caspase-1、IL-1β表达均显著升高。结论1.过量APAP引起小鼠急性肝损伤,激活线粒体自噬及NLRP3炎性小体介导的炎症反应。2.p62-Keap1-Nrf2抗氧化信号通路在APAP肝损伤的早期发挥保护作用。3.自噬激活剂-RAPA能引起自噬的进一步激活,清除受损线粒体,抑制炎性小体NLRP3激活,对APAP诱导的急性肝损伤起保护作用。