第一部分Nampt参与介导椎间盘退变过程一、研究背景腰痛在临床上极为常见,超过80%的人一生某个时间中将受到下腰痛的困扰,是目前导致人类残疾的首要原因。椎间盘退变及其继发疾病的一系列相关疾病是导致腰痛最重要的病因。研究证实,椎间盘退变伴随炎症因子表达增加,炎症反应是介导椎间盘退变最重要的病理生理过程,炎症因子或介质不仅能诱导细胞外基质分解酶表达增加、降低细胞外基质合成基因表达、还能诱导神经血管长入,从而引发椎间盘退变及疼痛。烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又称内胀脂肪素(Visfatin)和前B细胞克隆增强因子(PBEF),在1994年被首次发现。Nampt在有机体内广泛存在,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)补救合成途径的限速酶,研究表明,Nampt具有类炎症细胞因子样作用,参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,在免疫调节、炎症反应、代谢等相关疾病中均发挥重要作用。研究已证实Nampt可通过促炎作用介导细胞外基质降解,参与骨关节炎、类风湿关节炎等疾病的发生。但Nampt在椎间盘退变中的作用目前尚无文献报道,考虑椎间盘退变与骨关节炎、类风湿关节炎具有相似的病理生理机制,本研究拟对Nampt在椎间盘退变中的具体作用机制进行探讨。二、研究目的1、探讨Nampt在椎间盘退变过程中的表达;2、探讨阻断Nampt对椎间盘细胞外基质代谢的影响。三、研究方法1、获取因腰椎滑脱、腰椎管狭窄、腰椎间盘突出症需手术治疗患者的椎间盘组织(50例),按Pfirrmann分级分组,退变等级II级和III级为轻度退变组,退变等级IV级和V级为重度退变组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白印迹(WesternBlot)和免疫荧光法检测Nampt在不同退变等椎间盘标本中的表达。2、获取椎间盘标本后,采用酶消化法消化、培养髓核细胞,给予不同浓度IL-1β干预48小时或给予IL-1β(10ng/mL)干预不同时间后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,采用NAD活性检测试剂盒检测干预后髓核细胞NAD的活性。3、采用Nampt酶活性抑制剂APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。4、采用IL-1β(10ng/mL)、或APO866(10nmol/L)、或APO866(10nmol/L)预处理髓核细胞后联合IL-1β(10ng/mL)共干预髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、以及MMP-3和MMP-13的表达差异;采用qRT-PCR和蛋白印迹法检测细胞合成相关基因蛋白聚糖和II型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和II型胶原降解情况。5、构建三种shRNA质粒敲除载体(shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#)转染髓核细胞,qRT-PCR和蛋白印迹法检测Nampt的表达,NAD活性检测试剂盒检测细胞NAD的活性。6、采用空质粒颗粒Src、shRNA1#、shRNA2#、shRNA3#预先转染髓核细胞后,再采用IL-1β(10ng/mL)干预,qRT-PCR和蛋白印迹法检测ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和II型胶原的表达,细胞免疫荧光检测蛋白聚糖和II型胶原降解情况。四、研究结果1、本研究纳入的50例标本中,轻度退变等级26例,重度退变等级24例;qRT-PCR检测结果显示重度退变组Nampt在mRNA表达水平显著高于轻度退变组;蛋白印迹法和免疫组化结果显示重度退变组Nampt在蛋白表达水平也显著高于轻度退变组。2、不同浓度IL-1β干预后检测发现Nampt在mRNA水平和蛋白水平表达均随着IL-1β干预浓度增加而增加,呈剂量依赖性;且IL-1β干预不同时间后也发现Nampt表达随着干预时间延长而逐步增加,呈时间依赖性。3、APO866干预细胞后,Nampt表达不变,且APO866并不影响IL-1β诱导Nampt表达上调的作用;但APO866可显著降低髓核细胞中NAD活性,且可显著抑制IL-1β上调NAD活性的作用。4、IL-1β干预可显著上调细胞外基质分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的表达,且显著下调细胞外基质合成基因蛋白聚糖和II型胶原的表达;而APO866并不影响这些基因的表达,但可显著抑制IL-1β上调ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13的作用,以及抑制IL-1β下调蛋白聚糖和II型胶原的作用。5、三种质粒载体均可显著敲除髓核细胞中Nampt基因表达,无论mRNA层面还是蛋白层面,且可显著抑制细胞NAD活性。6、Nampt敲除后并不影响ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和II型胶原的作用,但shRNA1#和shRNA3#转染后可显著逆转IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调作用,且显著逆转IL-1β对蛋白聚糖和II型胶原分解的作用。五、研究结论1、椎间盘退变过程中伴随Nampt表达增加,且Nampt表达水平与椎间盘退变严重程度呈正相关,说明Nampt参与介导椎间盘退变过程。2、IL-1β具有诱导Nampt表达上调的作用,且抑制Nampt酶活性或敲除Nampt均可显著抑制IL-1β对细胞外基质分解的作用,说明IL-1β可能通过诱导Nampt介导椎间盘细胞外基质分解,从而诱导椎间盘退变,且阻断Nampt具有逆转椎间盘退变的作用。该研究为为椎间盘退变及腰痛的治疗提供新思路和新策略。第二部分APO866诱导细胞自噬延缓椎间盘退变的作用及机制一、研究背景自噬是哺乳动物体内细胞的一种分解代谢方式,在细胞代谢增加或在缺氧、营养匮乏等应激条件下,细胞将通过自噬机制,将受损的细胞器或蛋白等物质转运至自噬溶酶体中进行降解。细胞自噬是细胞发育和存活的重要途径,自噬持续时间过久或程度过强,超出细胞自身调节能力,将导致细胞代谢紊乱甚至凋亡等变化,因此细胞自噬对于维持细胞稳态具有重要作用。目前研究已证实,自噬与多种疾病的发生发展均密切相关,如炎症及免疫性疾病、神经及心血管系统疾病、以及癌症等。椎间盘退变与细胞衰老、缺氧、营养匮乏等具有紧密联系,椎间盘细胞凋亡、衰老或功能减弱是导致椎间盘退变的主要原因。近年来,研究发现细胞自噬也参与椎间盘退变过程,且大多数情况下对椎间盘退变起到保护作用。Nampt参与细胞代谢、凋亡、自噬等过程,既往研究表明,APO866可诱导细胞自噬,在缓解急性肝损伤以及抑制肿瘤方面发挥重要作用。然而,APO866是否具有诱导髓核细胞自噬及其在椎间盘退变中的作用目前尚不明确。二、研究目的1、探讨APO866诱导髓核细胞自噬的作用2、探讨APO866通过细胞自噬拮抗IL-1β对椎间盘细胞外基质降解的作用。三、研究方法1、体外培养髓核细胞,采用不同浓度APO866(0、1、5、10、20、100nmol/L)干预48小时后、或采用APO866(10nmol/L)干预不同时间(0、24、48、72、96h)后,CCK-8法检测细胞活性、单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。2、采用自噬抑制剂3-MA、或烟酰胺单核苷酸(NMN)、或人重组Nampt(r Nampt)预处理髓核细胞,再辅助IL-1β干预与不干预,单丹磺酰尸胺(MDC)检测自噬小体形成数量、蛋白印迹检测检测LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表达变化、免疫荧光检测LC3蛋白阳性的自噬体膜含量。3、髓核细胞单独给予IL-1β(10ng/m L)、或APO866(10nmol/L)、或APO866预干预2小时后给予IL-1β共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA共处理、或APO866预干预2小时后给予3-MA(10mmol/L)和IL-1β(10ng/m L)共处理48小时,无干预髓核细胞作为对照。q RT-PCR和蛋白印迹法检测细胞分解代谢相关基因ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13、以及蛋白聚糖和II型胶原的表达;采用细胞免疫荧光技术检测蛋白聚糖和II型胶原降解情况;Tunel检测细胞凋亡情况。四、研究结果1、APO866干预浓度达到20nmol/L以上时,髓核细胞活性显著下降。MDC染色发现髓核细胞自噬小体形成数量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。蛋白印迹检测发现LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表达随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性,且APO866干预48h时表达量达到峰值。细胞免疫荧光检测显示LC3蛋白阳性的自噬体膜含量随着APO866干预浓度增加而逐渐增加,呈剂量依赖性;且APO866干预48h时自噬小体数量达到峰值。2、自噬抑制剂3-MA可显著抑制由APO866诱导的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。NMN和r Nampt干预同样可抑制由APO866诱导的LC3-II/LC3-I比值和Beclin-1表达增加、LC3蛋白阳性的自噬体膜含量增加。3、自噬抑制剂3-MA并不能影响IL-1β对Nampt的诱导作用;APO866抑制IL-1β诱导ADAMTS-4和ADAMTS-5、MMP-3和MMP-13表达上调的作用被3-MA显著逆转;APO866抑制IL-1β降解蛋白聚糖和II型胶原的作用被3-MA显著逆转;APO866具有拮抗IL-1β诱导髓核细胞凋亡的作用,而这一作用被3-MA所逆转。五、研究结论Nampt酶活性抑制剂APO866具有诱导髓核细胞自噬的作用,且通过自噬作用可显著逆转由IL-1β介导的髓核细胞外基质分解作用。提示APO866有望成为治疗椎间盘退变新的分子靶点及药物。