【摘 要】
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目的越来越多的证据表明肿瘤微环境在胰腺癌的演进过程中扮演了重要的角色。本研究探讨肿瘤相关成纤维细胞募集中性粒细胞对胰腺癌PANC-1细胞增殖和迁移的影响。方法采用含1.3%DMSO的RPMI1640培养基培养HL-60细胞5天,使其诱导为类中性粒细胞（dHL-60）,建立体外中性粒细胞培养模型。制备胰腺癌PANC-1细胞的条件培养基,用PANC-1细胞条件培养基培养成纤维细胞（HFF）24h,获得
【基金项目】
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项目名称:胰腺星状细胞分泌GCP-2募集肿瘤相关中性粒细胞促进胰腺癌进展的分子机制研究,项目合同编号:81560387,项目来源:国家自然科学基金地区科学基金项目,项目起止时间:2016.1-2019.12; 项目名称:广西医科大学第一附属医院“优秀医学英才”科研创新能力培养项目,项目合同编号:180327,项目来源:广西医科大学第一附属医院,项目起止时间:2015.1-2020.12; 项目名称
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目的越来越多的证据表明肿瘤微环境在胰腺癌的演进过程中扮演了重要的角色。本研究探讨肿瘤相关成纤维细胞募集中性粒细胞对胰腺癌PANC-1细胞增殖和迁移的影响。方法采用含1.3%DMSO的RPMI1640培养基培养HL-60细胞5天,使其诱导为类中性粒细胞（dHL-60）,建立体外中性粒细胞培养模型。制备胰腺癌PANC-1细胞的条件培养基,用PANC-1细胞条件培养基培养成纤维细胞（HFF）24h,获得肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAF）,随后制备CAF的条件培养基。酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测成纤维细胞（HFF）和肿瘤相关成纤维细胞（CAF）条件培养基中粒细胞趋化蛋白-2（granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2）的含量。蛋白免疫印迹法（western blot）检测HL-60细胞和dHL-60细胞CXCR1（chemokine（C-X-C motif）receptor 1）和CXCR2（chemokine（C-X-C motif）receptor 2）的表达。同理用上述PANC-1细胞条件培养基重悬类中性粒细胞,放入细胞培养箱中培养24h使其转化为肿瘤相关中性粒细胞（Tumor associated neutrophil,TAN）。将TAN接种于transwell小室的上室,制备HFF的条件培养基后加入transwell的下室,并分为TAN对照组、TAN+HFF条件培养基组、TAN+HFF条件培养基+GCP-2抗体组和TAN+HFF条件培养基+人工重组GCP-2蛋白（rGCP-2）组。通过计数进入下室的TAN细胞数检测肿瘤相关成纤维细胞释放GCP-2对TAN细胞迁移能力的影响。ELISA检测类中性粒细胞（dHL-60）和肿瘤相关中性粒细胞（TAN）条件培养基中增殖诱导配体（A proliferation inducing ligand,APRIL）的含量。Western blot验证胰腺癌PANC-1细胞APRIL的受体B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）和跨膜激活剂及钙调素配基相互作用因子（transmembrane activator and CAML-interactor,TACI）的表达。将胰腺癌PANC-1细胞与dHL-60细胞进行共培养,并分为PANC-1细胞对照组、PANC-1+dHL-60细胞组、PANC-1+dHL-60细胞+APRIL抗体组和PANC-1+人工重组APRIL蛋白（r APRIL）组,采用CCK8（Cell counting kit-8）法测定dHL-60细胞释放APRIL对胰腺癌PANC-1细胞增殖活性的影响。Transwell细胞迁移实验分为PANC-1细胞对照组、PANC-1细胞+中性粒细胞组,检测PANC-1细胞迁移能力的变化。结果ELISA结果显示HFF和CAF细胞均表达GCP-2,CAF组条件培养基中GCP-2的水平显著高于HFF组（P<0.001）。蛋白免疫印迹法验证了dHL-60细胞表达GCP-2的受体CXCR1。TAN细胞在HFF条件培养基作用下培养的结果显示:TAN+HFF条件培养基组的TAN细胞数明显高于对照组（P<0.01）,提示在HFF释放GCP-2的条件下,TAN迁移能力增强。TAN+HFF条件培养基组的TAN细胞数显著高于TAN+HFF条件培养基+GCP-2抗体组（P0.05）。ELISA检测发现dHL-60和TAN细胞均表达APRIL,TAN组条件培养基中APRIL的水平显著高于dHL-60组（P<0.05）。蛋白免疫印迹法证实胰腺癌PANC-1细胞表面表达APRIL的受体BCMA和TACI。CCK8法显示:对照组PANC-1细胞活性显著低于PANC-1+TAN组（P<0.001）和PANC-1+r APRIL组（P<0.05）,提示在TAN释放APRIL或添加r APRIL的条件下,PANC-1活性上升;PANC-1+TAN组PANC-1活性显著高于PANC-1+TAN+APRIL抗体组（P<0.05）,提示在APRIL抗体作用下,减弱或阻断了APRIL的刺激,PANC-1活性下降。Transwell细胞迁移实验显示,胰腺癌PANC-1细胞+中性粒细胞组PANC-1细胞迁移数远多于胰腺癌PANC-1细胞组,差异有统计学显著性（P<0.05）。结论本研究初步证实肿瘤相关成纤维细胞可通过分泌GCP-2使TAN的迁移能力明显增强,促进招募中性粒细胞进入胰腺癌微环境成为肿瘤相关中性粒细胞;肿瘤相关中性粒细胞可通过释放APRIL作用于胰腺癌细胞,增强胰腺癌细胞的增殖和迁移能力。通过研究肿瘤相关成纤维细胞、TAN与胰腺癌细胞的相互作用,有可能为胰腺癌恶性进展的机制研究和临床改善胰腺癌的综合治疗效果提供新思路。
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