论文部分内容阅读
多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）在茶黄素酶法合成、蛋白质交联、红茶品质改善和茶饮料稳定性改善等食品领域有着广阔的应用前景。然而PPO酶源的短缺限制了其工业应用。本文利用香蕉基因组信息进行电子克隆得到香蕉PPO基因,以巴西香蕉果肉总RNA反转录产物为模板,经PCR获得了该基因的克隆,并进行原核表达,最终获得了具有酶活力的香蕉PPO工程蛋白,拓展了PPO的来源,为香蕉PPO的研究提供了研究基础。研究结果如下：（1）香蕉果肉总RNA的提取及优化以巴西青香蕉果肉为材料,研究了提取缓冲液种类、pH值和离子浓度,CaCl2的浓度、沉淀温度和沉淀时间,LiCl的沉淀时间对RNA纯度、得率和完整性的影响,得到优化的结果为：采用pH9.0的l00mM Tris-硼酸缓冲液作为提取缓冲液,使用100mmM的CaCl2于25℃沉淀20min去除多糖,3M LiCl沉淀RNA12h,可以得到纯度高、得率高和完整性好的总RNA。将LiCl沉淀12h换成用等体积的异丙醇-20℃C沉淀20mmin,依然能快速得到质量和完整性好的总RNA,但得率低。优化方法提取黄香蕉果肉、黄香蕉果皮、青香蕉果肉和青香蕉果皮的总RNA,进行RT-PCR,均能扩增出条带明亮的380bp的MaActin片段。（2）香蕉多酚氧化酶基因的电子克隆及序列分析以香蕉（Musa acuminata AAA Group Cavendish banana） PPO mRNA部分编码区序列（CDS） EU880277.1作为探针,在NCBI的香蕉（Musa） EST数据库中进行Blast搜索,得到1个高度同源的EST序列：ES436966.1。然后将此序列与香蕉（Musa） WGS数据库进行比对,找到了contig1794（CAIC01022631.1）。接着用FGENESH软件分析此contig后,预测得到一个全长为1773bp CDS,编码590个氨基酸。通过RT-PCR方法克隆获得该基因,序列分析表明该基因是编码香蕉PPO的新基因,序列长度为1767bp,编码588个氨基酸,与电子克隆得到的序列基本一致,命名为BXPPO1,并登录GenBank,登录号为：KF900300.1。（3）香蕉多酚氧化酶的生物信息学分析通过各种软件对香蕉PPO的核酸序列和氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明：香蕉PPO基因与禾本科（除高杆野生稻外）植物PPO基因有着较高的同源性,相似度在82%-85%之间,与蔷薇科鸡麻（DQ851219.1）亲缘关系最近。香蕉PPO最有可能存在于叶绿体中,不具有信号肽,没有跨膜区,含有一个长度为47个氨基酸的叶绿体转运肽。香蕉PPO蛋白属于酪氨酸酶基因家族蛋白,具有酪氨酸酶超级家族、PPO1DWL（?）（?）PP01KFDV三个保守结构域。香蕉PPO分子式为C2952H4526N800O866S19,含有588个氨基酸,分子量为65688.3Da,等电点为6.32,为亲水性蛋白质。此外对香蕉PPO二级结构进行了分析,并成功预测得到香蕉PPO的三级结构模型。（4）香蕉多酚氧化酶原核表达载体构建及原核诱导表达以pET22b（+）和pQE80L为表达载体,成功构建BXPP01-pET22b（+）、BXPPO2-pET22b（+）.BXPPOl-pQE80L和BXPP02-pQE80L四个原核表达载体。将构建好的表达载体BXPP01-pQE80L和BXPP02-pQE80L转化至宿主菌M15,BXPP01-pET22b（+）和BXPP02-pET22b（+）表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）,在不同IPTG浓度和不同诱导时间的条件下,BXPP01-pET22b（+）、BXPP02-pET22b（+）和BXPP01pQE80L的宿主菌未能表达出目的蛋白,BXPP02-pQE80L宿主菌表达出分子量约为62KDa的目的蛋白。（5）香蕉多酚氧化酶包涵体复性、纯化与质谱鉴定大量表达BXPP02蛋白,经变性后透析复性,复性后酶活力为23.61U/mg包涵体变性后,通过琼脂糖亲和介质（Ni）纯化,SDS-PAGE检测得到单一的目的条带。质谱鉴定重组表达蛋白为香蕉PPO。