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背景与目的：
卒中后中枢性疼痛(central post-stroke pain, CPSP)是由中枢神经系统内与感觉传导相关的区域发生卒中后引起的一类中枢神经病理性疼痛。其中，丘脑卒中造成的丘脑痛是一种典型的CPSP，严重影响患者生活质量。CPSP的发病机制至今不明且缺少有效的防治手段。临床上治疗CPSP的药物常常无效，如吗啡(morphine)或者疗效甚微并伴有严重副作用，如加巴喷丁(gabapentin)。因此，了解CPSP的分子机制很可能为疾病的治疗提供新思路。本研究首先建立了出血后丘脑痛小鼠模型，结合观察全身给予morphine和gabapentin对模型小鼠丘脑痛的影响，验证该模型能否模拟脑出血后丘脑痛的临床症状。大量研究发现兴奋的N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA )受体/突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)/神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)信号通路在周围神经损伤引起的外周神经病理性疼痛以及脑卒中的病理生理过程中都有重要作用，但该机制是否参与丘脑痛的发生和发展尚属未知。本研究通过阻断PSD-95-nNOS的蛋白-蛋白相互作用，观察了其对丘脑痛的影响。重要的是，本研究应用新一代RNA测序技术对出血受损的丘脑内全基因转录组进行了深度分析，观察在丘脑痛状态下有哪些基因表达发生了改变。最后，本研究对全转录组中差异表达变化最显著基因之一的Lipocalin2(LCN2)在丘脑痛中的表达变化进行了验证，并探讨其在丘脑痛发生发展过程中的作用。
方法：
1.向小鼠单侧丘脑腹后内侧核(VPM )微量注射四型胶原酶(CollⅣ;0.01U/10nl)建立出血后丘脑痛小鼠模型。向对照组小鼠VPM微量注射等量生理盐水。采用Nissl染色方法检测出血位点及损伤范围。监测小鼠运动协调功能并利用vonFrey丝，热刺痛仪和冷板实验检测小鼠疼痛行为变化。
2.评估gabapentin与morphine全身给药对小鼠疼痛行为的影响。采用Westernblot方法检测接受CollIV或生理盐水微量注射的小鼠丘脑、脊髓、背根神经节以及中脑水管周围灰质中阿片受体(MOR)的表达是否变化。
3.分别在丘脑出血发生前、后给与能够阻断PSD-95-nNOS相互作用的小分子化合物ZL006，探索其对丘脑痛的影响。检测小鼠疼痛行为和运动协调功能。采用免疫共沉淀(Co-IP)和Westernblot方法检测PSD-95-nNOS的结合情况和蛋白表达。应用Nissl染色方法检测小鼠丘脑出血损伤的影响。原代培养丘脑神经元细胞，结合单细胞RT-PCR技术，检测Nos1(nNOS)和Dlg4(PSD-95)在单个丘脑神经元细胞共表达情况。
4.建模成功后，分别于第3天和14天分离并收集CollⅣ/生理盐水微量注射小鼠注射侧(术侧)丘脑组织。利用新一代转录组测序(RNA-Seq)技术检测在此两个时间点丘脑组织内转录组表达的变化并采用实时荧光定量PCR技术进一步验证部分RNA-Seq结果。接着对得到的差异表达基因(DEGs)利用相应生物信息学技术进行分析，最后应用PANTHER系统对两个时间点中DEGs分别进行基因本体论(gene ontology, GO)分析，采用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)进行通路分析。
5.LCN2是在两个时间点检测到的全转录组中差异表达最显著的基因之一。采用Westernblot，实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术进一步检测小鼠出血丘脑组织中LCN2蛋白与mRNA的表达差异变化。利用脑立体定位仪对小鼠出血丘脑VPM内预先进行显微注射LCN2siRNA，观察预先抑制LCN2表达对模型小鼠运动协调功能、疼痛行为、以及脑组织学的影响。
结果：
1.模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足反射频数增高(P＜0.01)，对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期减短，术侧后足对刺激反应正常。这种痛觉异常现象会持续至少28天，运动协调功能正常，与临床出血后丘脑痛患者症状相似。
2.Gabapentin可有效抑制显微注射CollⅣ造成的模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足频数增高(P＜0.01)以及对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期降低的现象。Morphine只在建模3天时能轻微抑制模型小鼠对侧后足对机械刺激的反应缩足频数增高现象(P<0.05)。此外，模型小鼠的丘脑、脊髓、背根神经节以及中脑水管周围灰质中MOR蛋白表达没有差异(P＞0.05)。全身应用morphine对出血后丘脑痛的镇痛作用不明显，而gabapentin对丘脑痛模型小鼠有一定镇痛作用。
3.预先应用ZL006能够剂量依赖性显著抑制由丘脑出血引起的小鼠对侧后足对机械刺激缩足反射频数增加(P＜0.01)，丘脑出血引起的对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期缩短现象，但不影响运动协调功能。丘脑出血造成VPL/VPM区域的尼氏染色细胞数目显著降低(P＜0.01)，细胞膜蛋白中nNOS表达增多(P＜0.01)和nNOS与PSD-95相互作用增强(P＜0.01)，预先给与ZL006可以逆转上述现象(P＜0.01)。单细胞RT-PCR结果显示大约45.5%(5/11 )的丘脑神经元共表达Nos1和Dlg4。但是在建模后30min给与ZL006并没有观察到镇痛效果。说明预先全身性给与ZL006可有效减轻出血造成的VPM/VPL区细胞损伤并且缓解疼痛。验证了在中枢性神经元中，PSD-95-nNOS的蛋白-蛋白相互作用在诱导包括丘脑痛在内的神经病理性疼痛中的重要作用，进一步验证了动物模型的可行性。
4.RNA-Seq结果显示丘脑痛模型建立后第3天共检测到19958个差异表达基因(DEGs)，在第14天共检测到共19829个DEGs。实时荧光定量PCR结果验证了三个目的基因(KCNA2, TLR7, H19 )mRNA表达变化与RNA-Seq结果一致。对建模后第3天检测到的DEGs进行GO功能注释，结果显示基因在14条GO分子功能上和7条GO生物学过程上有富集现象(P＜0.01)。建模后第14天的基因在12条GO分子功能上和6条GO生物进程上有富集现象(P＜0.01)。KEGG结果显示，在第3天和第14天，DEGs分别在71条和63条KEGG通路上有富集现象(P＜0.01)。
5.两个时间点的结果均表明基因LCN2表达在丘脑痛中显著增高。与对照组相比，在建模后第3天和第14天接受CollⅣ显微注射小鼠的术侧丘脑组织中LCN2蛋白表达及mRNA水平均显著增高(P＜0.01)。行为学结果显示，体内转染LCN2siRNA可有效降低模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足反射频数(P＜0.01)，增长对热刺激(P＜0.01)、冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期。Nissl染色结果显示抑制LCN2的表达可有效减小出血范围，降低损伤面积(P＜0.01)。
结论：
1.损伤小鼠单侧丘脑内VPM/VPL区域可诱发对侧后足感觉异常，该方法成功建立了脑出血后丘脑痛小鼠模型。
2.干扰PSD-95-nNOS复合物的形成可有效预防小鼠丘脑痛的发生，为临床治疗提供了实验数据。
3.丘脑出血后会造成大量基因表达发生改变。其中，LCN2有可能成为出血后丘脑痛的新型治疗靶点。
卒中后中枢性疼痛(central post-stroke pain, CPSP)是由中枢神经系统内与感觉传导相关的区域发生卒中后引起的一类中枢神经病理性疼痛。其中，丘脑卒中造成的丘脑痛是一种典型的CPSP，严重影响患者生活质量。CPSP的发病机制至今不明且缺少有效的防治手段。临床上治疗CPSP的药物常常无效，如吗啡(morphine)或者疗效甚微并伴有严重副作用，如加巴喷丁(gabapentin)。因此，了解CPSP的分子机制很可能为疾病的治疗提供新思路。本研究首先建立了出血后丘脑痛小鼠模型，结合观察全身给予morphine和gabapentin对模型小鼠丘脑痛的影响，验证该模型能否模拟脑出血后丘脑痛的临床症状。大量研究发现兴奋的N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA )受体/突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)/神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)信号通路在周围神经损伤引起的外周神经病理性疼痛以及脑卒中的病理生理过程中都有重要作用，但该机制是否参与丘脑痛的发生和发展尚属未知。本研究通过阻断PSD-95-nNOS的蛋白-蛋白相互作用，观察了其对丘脑痛的影响。重要的是，本研究应用新一代RNA测序技术对出血受损的丘脑内全基因转录组进行了深度分析，观察在丘脑痛状态下有哪些基因表达发生了改变。最后，本研究对全转录组中差异表达变化最显著基因之一的Lipocalin2(LCN2)在丘脑痛中的表达变化进行了验证，并探讨其在丘脑痛发生发展过程中的作用。
方法：
1.向小鼠单侧丘脑腹后内侧核(VPM )微量注射四型胶原酶(CollⅣ;0.01U/10nl)建立出血后丘脑痛小鼠模型。向对照组小鼠VPM微量注射等量生理盐水。采用Nissl染色方法检测出血位点及损伤范围。监测小鼠运动协调功能并利用vonFrey丝，热刺痛仪和冷板实验检测小鼠疼痛行为变化。
2.评估gabapentin与morphine全身给药对小鼠疼痛行为的影响。采用Westernblot方法检测接受CollIV或生理盐水微量注射的小鼠丘脑、脊髓、背根神经节以及中脑水管周围灰质中阿片受体(MOR)的表达是否变化。
3.分别在丘脑出血发生前、后给与能够阻断PSD-95-nNOS相互作用的小分子化合物ZL006，探索其对丘脑痛的影响。检测小鼠疼痛行为和运动协调功能。采用免疫共沉淀(Co-IP)和Westernblot方法检测PSD-95-nNOS的结合情况和蛋白表达。应用Nissl染色方法检测小鼠丘脑出血损伤的影响。原代培养丘脑神经元细胞，结合单细胞RT-PCR技术，检测Nos1(nNOS)和Dlg4(PSD-95)在单个丘脑神经元细胞共表达情况。
4.建模成功后，分别于第3天和14天分离并收集CollⅣ/生理盐水微量注射小鼠注射侧(术侧)丘脑组织。利用新一代转录组测序(RNA-Seq)技术检测在此两个时间点丘脑组织内转录组表达的变化并采用实时荧光定量PCR技术进一步验证部分RNA-Seq结果。接着对得到的差异表达基因(DEGs)利用相应生物信息学技术进行分析，最后应用PANTHER系统对两个时间点中DEGs分别进行基因本体论(gene ontology, GO)分析，采用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)进行通路分析。
5.LCN2是在两个时间点检测到的全转录组中差异表达最显著的基因之一。采用Westernblot，实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术进一步检测小鼠出血丘脑组织中LCN2蛋白与mRNA的表达差异变化。利用脑立体定位仪对小鼠出血丘脑VPM内预先进行显微注射LCN2siRNA，观察预先抑制LCN2表达对模型小鼠运动协调功能、疼痛行为、以及脑组织学的影响。
结果：
1.模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足反射频数增高(P＜0.01)，对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期减短，术侧后足对刺激反应正常。这种痛觉异常现象会持续至少28天，运动协调功能正常，与临床出血后丘脑痛患者症状相似。
2.Gabapentin可有效抑制显微注射CollⅣ造成的模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足频数增高(P＜0.01)以及对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期降低的现象。Morphine只在建模3天时能轻微抑制模型小鼠对侧后足对机械刺激的反应缩足频数增高现象(P<0.05)。此外，模型小鼠的丘脑、脊髓、背根神经节以及中脑水管周围灰质中MOR蛋白表达没有差异(P＞0.05)。全身应用morphine对出血后丘脑痛的镇痛作用不明显，而gabapentin对丘脑痛模型小鼠有一定镇痛作用。
3.预先应用ZL006能够剂量依赖性显著抑制由丘脑出血引起的小鼠对侧后足对机械刺激缩足反射频数增加(P＜0.01)，丘脑出血引起的对热刺激(P＜0.01)和冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期缩短现象，但不影响运动协调功能。丘脑出血造成VPL/VPM区域的尼氏染色细胞数目显著降低(P＜0.01)，细胞膜蛋白中nNOS表达增多(P＜0.01)和nNOS与PSD-95相互作用增强(P＜0.01)，预先给与ZL006可以逆转上述现象(P＜0.01)。单细胞RT-PCR结果显示大约45.5%(5/11 )的丘脑神经元共表达Nos1和Dlg4。但是在建模后30min给与ZL006并没有观察到镇痛效果。说明预先全身性给与ZL006可有效减轻出血造成的VPM/VPL区细胞损伤并且缓解疼痛。验证了在中枢性神经元中，PSD-95-nNOS的蛋白-蛋白相互作用在诱导包括丘脑痛在内的神经病理性疼痛中的重要作用，进一步验证了动物模型的可行性。
4.RNA-Seq结果显示丘脑痛模型建立后第3天共检测到19958个差异表达基因(DEGs)，在第14天共检测到共19829个DEGs。实时荧光定量PCR结果验证了三个目的基因(KCNA2, TLR7, H19 )mRNA表达变化与RNA-Seq结果一致。对建模后第3天检测到的DEGs进行GO功能注释，结果显示基因在14条GO分子功能上和7条GO生物学过程上有富集现象(P＜0.01)。建模后第14天的基因在12条GO分子功能上和6条GO生物进程上有富集现象(P＜0.01)。KEGG结果显示，在第3天和第14天，DEGs分别在71条和63条KEGG通路上有富集现象(P＜0.01)。
5.两个时间点的结果均表明基因LCN2表达在丘脑痛中显著增高。与对照组相比，在建模后第3天和第14天接受CollⅣ显微注射小鼠的术侧丘脑组织中LCN2蛋白表达及mRNA水平均显著增高(P＜0.01)。行为学结果显示，体内转染LCN2siRNA可有效降低模型小鼠对侧后足对机械刺激的缩足反射频数(P＜0.01)，增长对热刺激(P＜0.01)、冷刺激(P＜0.01)的缩足潜伏期。Nissl染色结果显示抑制LCN2的表达可有效减小出血范围，降低损伤面积(P＜0.01)。
结论：
1.损伤小鼠单侧丘脑内VPM/VPL区域可诱发对侧后足感觉异常，该方法成功建立了脑出血后丘脑痛小鼠模型。
2.干扰PSD-95-nNOS复合物的形成可有效预防小鼠丘脑痛的发生，为临床治疗提供了实验数据。
3.丘脑出血后会造成大量基因表达发生改变。其中，LCN2有可能成为出血后丘脑痛的新型治疗靶点。