甲型流感病毒属于正粘病毒科，是一类分节段、有包膜的单股负链RNA病毒，是引起季节性流行性感冒的主要病原体。近年来，季节性流感高发，而且禽流感不断跨越物种屏障感染人，特别是H7N9和高致病性禽流感H5N1疫情时有发生，不仅严重威胁人类健康，而且给畜牧业生产造成重大损失，已成为严重的公共卫生问题。目前人们对流感病毒感染尚没有有效疗法。鉴于近两年流感病毒频繁暴发，所以研发有效抑制流感病毒感染的方法就显得尤为重要。　　甲型流感病毒主要感染人或禽畜呼吸道及肺上皮细胞，其生活周期离不开宿主因子的参与。microRNA (miRNA)作为一种大小约21-23个碱基的单链小分子非编码RNA，通过与mRNA(通常3UTR)相互作用调控基因的转录后表达，进而广泛影响肿瘤、炎症、病毒感染等生物学和病理学过程。前期已有流感感染后miRNA变化的系列报道以及零星的miRNA对流感病毒调控的研究，而有关内源miRNA整体对病毒复制的全面作用和miRNA介导的抗病毒机制还有待进一步研究。本研究主要目的就是系统全面筛查调控甲型流感病毒复制的miRNA并进一步探讨其机制，为基于miRNA的抗病毒治疗提供借鉴。　　本研究中，我们建立起一个在人和小鼠呼吸道上皮细胞表达丰度较高的所有miRNA的文库，文库包含297个内源miRNA。然后利用双荧光素酶报告筛选体系进行初步筛选，筛选获得87和80个miRNA分别能调控（绝大部分是抑制）PR8和H3N2两株毒株的复制，其中25个miRNA对PR8和H3N2具有相同的调控作用。接着，通过检测流感病毒M1的mRNA水平和NP的蛋白水平，对这25个miRNA进行验证，最终得到5个对PR8和H3N2复制有显著抑制作用的miRNA: hsa-mir-1-3p、 hsa-mir-127-3p、hsa-mir-486-5p、 hsa-mir-593-5p和mmu-mir-487b-5p。应用antagomir降低上皮细胞中这5个miRNA本底表达发现流感病毒的复制得到促进，表明miRNA对流感病毒的抑制可以被miRNA抑制剂逆转。　　进一步探究这5个miRNA发挥抑制流感病毒作用的机制，通过靶点预测、3UTR荧光报告和病毒感染实验发现hsa-mir-127-3p、hsa-mir-486-5p、hsa-mir-593-5p和mmu-mir-487b-5p通过靶向流感病毒的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS mRNA直接抑制病毒的复制，而hsa-mir-1-3p则通过靶向利于流感病毒复制的宿主因子ATP6V1A降低其蛋白水平，进而间接抑制流感病毒的复制，联合这5个miRNA对流感病毒的抑制有明显的协同作用。小鼠攻毒试验表明，以agomirs的形式输送这5个miRNA进行治疗，可以显著抑制病毒的复制、保护小鼠免受病毒的致死侵害。这为以基于miRNA的抗流感病毒治疗提供了依据。　　这5个miRNA联合使用对不同人流感、禽流感病毒毒株PR8、WSN、H3N2、pH1N1和H9N2的抑制效果存在差异。通过分析这5株毒株以及其它禽流感、猪流感、人流感病毒的基因序列，发现miRNA对病毒的抑制率与病毒RNA含有的miRNA的靶点总数和含靶点的病毒RNA节段数量存在一定的正相关。这揭示了上皮细胞中表达的内源miRNA介导抗流感病毒防御体系，不仅在抵御病毒感染中发挥作用，也可能在抑制病毒跨种传播中有重要作用。　　综上所述，我们系统筛选了来自人和小鼠呼吸道上皮细胞中表达的297个miRNA，通过体外和体内实验鉴定了5个有效抑制流感病毒复制的抑制性miRNA。鉴于在流感病毒和宿主的相互作用中miRNA发挥广泛的调节功能，本研究为更好的了解miRNA引发的抵御流感病毒感染机制提供了基础，并为利用miRNA治疗和预防流感病毒感染提供了依据。