一、研究背景膀胱癌（bladder cancer,BCa）目前仍然是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,据统计,在美国2016年膀胱癌的新发病例数约为74,000人,约16,000人因膀胱癌而死亡。中国BCa的发病率相比美国较低,但发病率逐年升高,这也可能与医疗水平的进步和国人保健意识的增强有关。BCa根据膀胱内肿瘤局部侵犯的层次和深度,可分为两大类:非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）,又称浅表性膀胱癌,和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）,又称浸润性膀胱癌。在初次因膀胱肿瘤就诊的所有患者中,70-80%患者被诊断为患有NMIBC,其中10-20%的病例将最终会进展成为MIBC。同时,约有20-30%的患者当时就被确诊为患有MIBC。这两种亚型BCa的疾病自然史与预后相差甚远,肿瘤出现肌层浸润性生长的膀胱癌患者容易出现远处转移而导致患者死亡,转移性膀胱癌5年生存率不超过20%。关于BCa细胞在人体内增殖、进展并转移的具体原因及内在分子机制迄今尚不明确,由此可见,进一步深入研究BCa特有的恶性增殖的内在分子机制,明确阐明BCa发生和发展的机理,可为将来进一步治疗BCa提供潜在的新的分子靶标。PPP5C属于PPP蛋白磷酸酶催化家族,是在真核生物体中普遍存在并高度守旧的一个基因家族,该家族的蛋白质参与介入调控可逆性磷酸化丝氨酸残基和苏氨酸残基的途径,在细胞内多种重要的生物学活动的过程发挥重要作用,包括细胞成长、细胞凋亡、DNA修复、生物钟调节、类固醇类激素受体的成熟、溶血抑制因子e IF2a激酶的合成、细胞应激反应等,涉及到的细胞内重要的信号通路分子包MAPK、ATM、ATR、P53、GR以及ASK1等,在生命体内组成复杂的调控回路。PPP5C已知在人体各个组织器官中都有表达,并且在一些肿瘤细胞中,PPP5C的表达水平升高。Ghobrial IM等人的芯片数据提示套细胞淋巴瘤中PPP5C的表达水平是对照组的两倍。Honkanen,R.E.等人大于250例数据的组织芯片提示PPP5C在乳腺癌组织中增高显著。以上结果提示:异常高水平表达的PPP5C可能在癌细胞的增殖和转移中发挥了重要的功能。近来,先后有研究报道PPP5C能够促进肝癌、胶质瘤、结肠癌、卵巢癌、淋巴瘤等肿瘤细胞的恶性分化,提示PPP5C基因在肿瘤细胞的异常增殖、转移以及凋亡中发挥癌基因的作用,然则PPP5C在BCa中的研究尚无报道。二、实验目的通过收集比较Oncomine数据库膀胱癌样本中癌与癌旁的PPP5C的表达水平,评估PPP5C与膀胱癌分期、分级、预后的相关性,并通过临床组织标本切片免疫组化确认PPP5C在癌及癌旁的表达水平;进一步在细胞水平中用慢病毒载体成功构建得到能稳定沉默PPP5C的表达的细胞株,研究PPP5C敲低后对BCa细胞的迁移、增殖、克隆形成等肿瘤生物学表型的影响,构建裸鼠成瘤模型,体内验证抑制PPP5C对肿瘤生长速度的影响,并初步探索PPP5C对相关下游分子的调控机制。三、实验方法（一）统计PPP5C在Oncomine数据库中膀胱癌与正常膀胱粘膜组织中的表达程度,分析其与肿瘤分级分期及预后的相关性收集Oncomine数据库中的7组膀胱癌及正常膀胱粘膜组织的样本信息,分析PPP5C在癌和癌旁组织中的表达程度差异,绘制差异PPP5C表达水平患者的生存曲线,进一步分析不同肿瘤分期和不同肿瘤分级BCa组织中PPP5C的表达差异。（二）免疫组化分析临床组织标本中癌及癌旁组织中PPP5C的表达情况2014.9-2016.2在第二军医大学附属长征医院收集膀胱肿瘤患者行经尿道膀胱肿瘤电切术后病理标本,术中注意分别留取肿瘤及周围正常上皮组织样品,分别放置福尔马林溶液及液氮保存备用。每例病人标本分别在病理科医师经HE染色下验证癌及正常膀胱粘膜上皮组织。随机选取切片库中20例膀胱癌及癌旁组织标本,按照制备常规方法包埋成石蜡切片,运用免疫组织化学染色法探索PPP5C在癌与癌旁组织中的蛋白表达水平,同时收集部分手术患者的一般临床资料和随访预后信息进行统计分析。（三）构建能够稳定沉默PPP5C的慢病毒质粒及相应的膀胱癌细胞株模型选取BCa细胞株T24和BT5637作为研究工具模型,并将构建完成的靶向敲减PPP5C的慢病毒质粒sh RNA-PPP5C转染上述两株细胞株。观察记录相应质粒上的报告基因荧光表达情况,并进一步用Western Blot和q PCR来验证PPP5C的沉默效率,确认低表达PPP5C的BCa细胞株模型的成功建立。（四）检测在BCa细胞模型T24和BT5637中沉默PPP5C后,这两组细胞株的增殖克隆形成、转移能力的影响,同时流式细胞术明确细胞周期和凋亡的情况,并构建裸鼠皮下成瘤模型,体内验证肿瘤细胞成瘤能力的改变。在前期成功沉默PPP5C后的T24和BT5637细胞系的基础上,通过MTT（增殖）、克隆形成、划痕等实验等来探索对BCa细胞株生物学表型的影响;同时通过流式细胞术来分析肿瘤细胞周期及凋亡的变化情况。将前期成功沉默PPP5C的膀胱癌细胞,通过皮下注射的方法,构建裸鼠成瘤模型,观察裸鼠皮下肿瘤瘤体的直径、重量和体积等方面的差异。（五）PPP5C调控膀胱癌增殖侵袭的下游分子机制的初步验证前几步研究实验发现稳定沉默PPP5C,膀胱癌细胞的增殖侵袭能力出现明显的抑制,证实该分子对BCa细胞的成瘤和转移具有显著的影响。故我们采用Western Blot的方法对转移及增殖相关的分子进行初步筛选检测,并对PPP5C影响的信号通路进行了初步探索。四、实验结果1、数据库分析及免疫组化结果证实膀胱癌组织和癌旁组织中PPP5C的表达程度存在明显差别（p＜0.05）,BCa组织中的表达程度明显高于癌旁;进一步通过生物信息学分析PPP5C的表达程度与膀胱癌肿瘤分期、肿瘤分级正相关,并且与肿瘤患者的预后有关联。2、成功构建能稳定沉默PPP5C的慢病毒载体后,转染膀胱癌细胞株T24和BT5637后细胞的增殖、迁移以及克隆形成等能力都受到了显著的抑制。通过流式细胞检测技术发现肿瘤细胞选在G0/G1期阻滞并诱导凋亡细胞增加;裸鼠皮下荷瘤实验显示,沉默PPP5C肿瘤细胞形成的肿瘤体积、重量均低于对照组。3、在沉默PPP5C的T24和BT5637细胞株中,Western Blot验证了周期相关蛋白c-Myc、CDK4下调,同时自噬相关蛋白Beclin1、P27、BAD出现上调。进一步检测细胞自噬直接通路相关分子,ATGs、LC3B表达量升高,证实细胞自噬作用的增强。五、实验结论本课题研究表明,PPP5C在BCa中作为癌基因对肿瘤的增殖转移发挥了重要作用。在BCa细胞株模型T24和BT5637中沉默PPP5C的表达程度后,其相关肿瘤细胞恶性表型如:增殖、克隆形成、迁移能力出现明显的下降,提示PPP5C可能是BCa潜在的治疗靶点。