人的食管下括约肌(Lower esophageal sphincter,LES)是位于食管胃结合部(Esophagogastric junction,EGJ)局部增厚的环形肌束,由套索纤维和钩状纤维两部分组成,宽约2-3厘米。1979年Liebermann-Meffert第一次提出这一概念,并指出人LES由位于胃底小弯侧的钩状纤维(clasp fibres)和位于胃底大弯侧的套索纤维(sling fibers)共同组成。钩状纤维为半环形,套索纤维呈斜向分布,两者以及膈脚在食管胃结合部形成局部高压带,并在神经,体液等多种因素调解下使食管下括约肌生理状态下保持关闭的状态。在不吞咽食物时可以防止胃内容物反流,当进食时食管下括约肌暂时性舒张使食物进入胃腔。食管下括约肌舒张和收缩反应的调节是在中枢神经系统支配下,由自身肌源性因素、神经递质和激素等共同发挥作用而形成的。迷走神经节前纤维一方面通过肌间神经丛,另一方面通过抑制性和兴奋性神经通路对食管下括约肌进行舒张和收缩功能的调节。兴奋性和抑制性节前神经细胞分别位于迷走神经背侧运动核的前部和尾部。兴奋性运动传导通路由节前和节后胆碱能运动神经元组成,抑制性运动神经元由节前胆碱能神经元与节后非胆碱能非肾上腺素能神经元组成。兴奋性或抑制性神经通路激活后导致胆碱能节后神经元或胃肠道神经元神经递质的释放,这些释放的递质通过影响肌源性张力实现对食管下括约肌舒缩功能的调节。对食管下括约肌产生调控作用的交感神经源位于T6-T10部位的脊髓节段。内脏节前神经纤维属于胆碱能神经元,它作用于腹腔神经节而激活去甲肾上腺素能节后神经元从而发挥调节食管下括约肌的功能,也可与肠道运动神经元形成突触联系来完成调节作用。研究表明,食管运动障碍性疾病如弥漫性食管痉挛、胃食管反流病、贲门失弛症以及胡桃夹食管等疾病的发病机理均与食管下括约肌功能异常相关。因此,对食管下括约肌的功能研究对食管运动障碍性疾病的诊疗具有重要意义。国内外对于食管下括约肌的研究表明其调节机制涉及多种受体及其信号传导通路,其中多种神经递质也发挥重要的作用。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),作为一种神经递质和血管活性物质广泛存在于中枢神经系统和外周组织中,在感觉运动、情绪、心血管功能以及呼吸、食欲等多方面发挥作用。5-HT通过作用于不同受体,在胃肠道的运动、感觉和分泌调解中起到重要作用。5-HT受体分型复杂,现已确认人体存在7种5-HT受体类型并进一步细分为16种亚型,除5-HT3受体为电压门控通道受体外,其余均为G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)。本课题采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时定量聚合酶链反应(q PCR)和蛋白印迹法(Western-blot)测定5-HT受体在人食管下括约肌的表达情况,应用新鲜离体肌条张力测定和电场刺激(Electrical field stimulation,EFS)方法研究5-HT受体对人食管下括约肌收缩和舒张功能的作用。本课题研究结果为进一步探讨5-HT受体在人食管下括约肌调节机制中的作用奠定了基础,从而为完整的阐述人食管下括约肌调节机制并治疗食管运动功能障碍性疾病提供重要依据。第一部分5-羟色胺受体在人食管下括约肌表达的研究目的:5-羟色胺受体中的5-HT3受体是电压门控通道受体,除此之外的其他受体为G蛋白偶联受体。第一部分实验先应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量聚合酶链反应(q PCR)测定7种5-HT受体m RNA在人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维及食管环形肌和胃底环形肌的表达,而后应用蛋白印迹法(Western-blot分析)测定7种受体在上述各部位的蛋白表达。方法:河北医科大学附属第四医院胸外科2012年1月至2012年5月诊断为胸中段食管癌做食管大部切除及消化道重建术的患者27例,男性16例,女性11例,平均年龄57岁。手术间切除食管后即刻采集新鲜食管下段与胃结合部组织,用刀片将食管下端至胃近端组织的粘膜和粘膜下层彻底剔除掉并注意保护肌层完整。食管下括约肌(LES)为食管下端与胃交接部位局部增厚的环形肌束,胃小弯侧的是钩状纤维,胃大弯侧的为套索纤维,分别制备钩状纤维、套索纤维、食管环形肌和胃底环形肌四种肌条。被肿瘤组织侵犯的标本需被摒弃。在实验室分别提取四个位点肌条的总RNA,首先对组织的完整性和纯度进行检测,再用七种特异的5-HT受体亚型引物进行RT-PCR检测。结果显示七种5-HT受体m RNA在4个部位的肌条均表达,然后使用实时定量PCR检测不同受体亚型的相对含量。之后提取四个不同部位组织肌条组织蛋白,使用电泳仪分离各个5-HT受体亚型相应蛋白并转膜,最后应用特异性的抗体进行孵育过夜。结果由红外荧光扫描成像系统显像,经Gel Pro软件分析各受体反应条带的光密度值(IOD)与内参受体蛋白的IOD值的比,由此了解各受体蛋白表达水平。结果:内参β-actin于540bp处亮度均匀,各个反应中内参β-actin的PCR扩增结果一致。七种5-HT受体亚型m NRA在四组肌条中均有表达,扩增长度和实验设计长度吻合。不同组织肌条中各个5-HT受体亚型m NRA表达存在统计学差异(F=81.281;P=0.000),其受体亚型表达水平的强度均依次为:5-HT3AR=5-HT4R>5-HT1AR=5-HT2AR>5-HT5AR=5-HT6R=5-HT7R。同一个5-HT受体亚型的m RNA表达在4种肌条间表达没有统计学差异(F=0.218,P=0.695)。除了5-HT5和5-HT6受体外,5-HT1A、5-HT2A、5-HT3A、5-HT4和5-HT7受体蛋白在四种肌条中均有表达,分子量分别是48KD、46KD、53KD、55KD、44 KD和54KD。不同亚型5-HT受体蛋白在相同肌条内的表达存在统计学差异(F=648.269,P=0.000),蛋白表达水平和不同受体亚型m RNA表达水平一致,即蛋白表达水平从高到低为:5-HT3AR=5-HT4R>5-HT1AR=5-HT2AR>5-HT7R。同一种亚型的5-HT受体蛋白表达在四个不同肌条间比较不存在统计学差异(F=0.194,P=0.801)。结论:人食管下括约肌存在多种5-HT受体亚型,其m NRA表达水平依次为:5-HT3AR=5-HT4R>5-HT1AR=5-HT2AR>5-HT5AR=5-HT6R=5-HT7R。没有检测到5-HT5和5-HT6受体蛋白在人食管下括约肌表达,其余受体蛋白表达水平依次为:5-HT3AR=5-HT4R>5-HT1AR=5-HT2AR>5-HT7R。除5-HT5和5-HT6受体,其余5种5-HT受体在人食管下括约肌功能调节中可能起作用。第二部分5-羟色胺受体在人食管下括约肌调节机制中的作用目的:研究非选择性5-HT受体激动剂和拮抗剂及选择性的5-HT3、5-HT4和5-HT7受体拮抗剂和激动剂作用于人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维的效应,探究5-HT受体在人食管下括约肌舒缩功能调节中的作用。方法:选取2012年4月至2012年10月在河北医科大学附属第四医院胸外科因胸中段高位食管癌行手术治疗的患者29例,男性15例,女性14例,平均年龄59岁。手术室即刻采取新鲜食管胃连接部组织放入4℃Krebs液,标本洗净后粘膜面向上置于盛放Krebs液体的蜡盘中并妥善固定,含5%CO2和95%O2的气体持续通入保持肌条活性。用手术刀自标本的胃大弯侧剖开,锐性分离食管胃结合部的粘膜层及粘膜下层,区分出结合部局部增厚的肌肉层即为食管下括约肌,分别找到并分离胃大弯侧斜行分布的套索纤维与小弯侧半环形的钩状纤维,并制备2mm×10mm规格的肌条。将肌条结扎牢固,垂直悬挂在含10毫升Krebs液并37℃恒温的浴槽中,以含95%O2和5%CO2的混合气体持续通入。固定肌条下端并在上端连接JZ101型张力换能器,肌条张力变化情况由Medlab信号采集器记录。缓慢牵拉肌条至张力固定于200mg,设定此时肌条长度为初始长度L0,然后牵拉肌条并每次增加初始长度的25%左右,每次牵拉结束后需稳定15分钟再下一次牵拉,如此反复直至肌条长度等于初始长度的2倍即为肌条最适初长度。保持肌条于最适初长度约30分钟,以浓度累加方式加入非选择性的5-HT受体激动剂Serotonin。给药浓度为依次为:10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L。每次加药后记录肌条张力变化情况,待前一浓度药物使肌条达到最大反应且张力稳定10分钟后再加入下一浓度激动剂,藉此建立累计给药的浓度-反应量效曲线。观察拮抗剂效应时,需在加入激动剂前30分钟加入非选择性拮抗剂Methysergide maleate。选择性的5-HT3、5-HT4和5-HT7受体激动剂与拮抗剂的加药方法同前,肌条舒缩反应以百分比的均数±标准误(x±SE)来表示。结果1非选择性5-HT受体激动剂Serotonin和非选择性5-HT受体拮抗剂Methysergide maleate对人LES的作用非选择性5-HT受体激动剂Serotonin在10-9至10-3mol/L浓度都能诱导人食管下括约肌的钩状纤维、套索纤维产生收缩反应,在10-4mol/L时两种肌纤维产生最大的收缩反应,在各个浓度时两种肌纤维产生的收缩反应比较差异无统计学意义(P=0.67)。应用非选择性5-HT受体拮抗剂Methysergide maleate可以抑制Serotonin对钩状纤维、套索纤维状纤维所产生的收缩反应。表现为加入拮抗剂后,食管下括约肌两种纤维没有发生收缩反应。2选择性5-HT3受体激动剂2-Methyl-5-HT和拮抗剂Granisetron对人LES的作用选择性的5-HT3受体激动剂2-Methyl-5-HT在10-9至10-3mol/L浓度可以诱导人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维产生收缩反应,在10-4mol/L时,肌条均达到最大收缩百分比,钩状纤维为35±5.8%,套索纤维为37±6.7%。应用选择性的5-HT3受体拮抗剂Granisetron后,2-Methyl-5-HT诱导肌条产生的收缩明显下降,钩状纤维最大收缩百分比为8.4±1.5%,套索纤维最大收缩百分比为9.1±1.2%。应用激动剂和拮抗剂时钩状纤维和套索纤维间收缩百分比之间差异无统计学意义(P=0.63)。应用拮抗剂前后钩状纤维和套索纤维收缩反应百分比较差异均有统计学差异(P<0.01)。3选择性5-HT4受体激动剂Tegaserod和拮抗剂GR113808对人LES的作用选择性的5-HT4受体激动剂Tegaserod在10-9至10-3mol/L浓度均可引起钩状纤维和套索纤维发生收缩,在10-4 mol/L时,肌条均达到最大收缩百分比,钩状纤维为44±7.7%,套索纤维为46±8.3%。应用选择性的5-HT4受体拮抗剂GR113808后,Tegaserod诱导肌条产生的收缩百分比显著下降,钩状纤维最大收缩百分比为9.2±1.8%,套索纤维最大收缩百分比为10.1±1.5%。应用激动剂和拮抗剂时钩状纤维和套索纤维的收缩百分比之间差异无统计学意义(P=0.52)。应用拮抗剂前后钩状纤维和套索纤维收缩反应百分比较差异均有统计学差异(P<0.01)。4选择性5-HT7受体激动剂LP-44和拮抗剂SB269970对人LES的作用选择性的5-HT7受体激动剂LP-44对人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维没有产生影响,表现为应用各个浓度的5-HT7受体激动剂LP-44和拮抗剂SB269970时钩状纤维和套索纤维均无明显反应。结论1非选择性5-HT受体激动剂Serotonin可以诱导人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维均发生收缩反应。应用5-HT受体非选择性拮抗剂可以抑制Serotonin诱发的收缩反应,提示5-HT应当是通过5-HT受体来发挥对食管下括约肌的收缩作用。2选择性的5-HT3受体激动剂2-Methyl-5-HT和5-HT4受体激动剂Tegaserod均可引发食管下括约肌产生收缩反应,应用选择性的5-HT3拮抗剂Granisetron和5-HT4受体拮抗剂GR113808均可以抑制其激动剂产生的收缩反应,提示5-HT3和5-HT4受体可能参与人食管下括约肌的收缩功能调节。3选择性的5-HT7受体激动剂LP-44及拮抗剂SB269970对食管下括约肌不能产生舒缩反应,提示5-HT7受体可能并未参与人食管下括约肌的舒缩功能调节。第三部分5-羟色胺受体在电刺激诱导人食管下括约肌反应中作用的研究目的:研究电场刺激对食管下括约肌的作用,明确电场刺激时5-HT3、5-HT4和5-HT7受体拮抗剂对食管下括约肌的影响,研究5-HT受体在人食管下括约肌神经调节中的作用。方法:研究对象为河北医科大学第四医院胸外科2012年8月至2012年11月因胸中段食管癌手术的患者25例,男性13例,女性12例,平均年龄为62岁。钩状纤维和套索纤维的制备同第二部分所述。肌条垂直悬挂在含10毫升Krebs液并保持37℃恒温的浴槽中,持续通入含95%O2和5%CO2的混合气体。肌条下端同带铂金电极的L形架固定在一起,肌条上端连接JZ101型肌肉张力换能器,肌条张力变化情况由Medlab信号采集器采集。采用第二部分实验的方法使肌条达到最适初长度,然后使肌条在Krebs液中温浴1个小时后行EFS。肌条置于平行的铂金电极之间,肌条两端和电极之间距离大于3mm,在电极一端用实验仪器对肌条行电场刺激(EFS)。EFS参数:电压50V、波宽5ms、频率1~512Hz并以倍数增加(1Hz,2Hz,4Hz,8Hz,16Hz,32Hz,64Hz,128Hz,256Hz,512Hz),按频率从小到大进行EFS,施行完各频率EFS后计算刺激后的最大效应即为Emax。EFS刺激停止且肌条恢复平衡后加入河豚毒素(TTX),给药20分钟后再行EFS,对比加药前后肌条对EFS刺激的反应。刺激停止肌条恢复平衡后,分别加入选择性的5-HT3受体拮抗剂Granisetron,选择性的5-HT4受体拮抗剂GR113808和选择性5-HT7受体拮抗剂SB269970,给药20分钟后再行EFS,比较用药前后肌条对EFS刺激的反应。采用肌条舒缩的百分比均数±标准误(x±SE)来记录EFS诱发肌条产生的反应。结果1 EFS可引发钩状纤维和套索纤维产生频率依赖性舒张反应,最大舒张反应时频率均为64Hz,钩状纤维和套索纤维最大舒张百分比分别为(19.1±2.3)%和(21.3±2.7)%,应用EFS引发的两种纤维舒张反应差异无统计学意义(F=0.21,P=0.66)。2 TTX可以显著减弱由EFS引发的人食管下括约肌的舒张反应,加入TTX后肌条的舒张力下降,加入TTX前后舒张反应比较差异有统计学差异。3 EFS诱导人食管下括约肌产生肌频率依赖性舒张反应,选择性5-HT4受体拮抗剂GR113808对其舒张反应产生影响,用药前后舒张反应差异有统计学差异。4 EFS诱导人食管下括约肌产生肌频率依赖性舒张反应,应用选择性5-HT3、5-HT7受体拮抗剂Granisetron和SB 269970对其舒张反应无显著影响,用药前后舒张反应差异不具有统计学差异。结论1电场刺激可以引发人食管下括约肌出现频率依赖性舒张反应,当电场刺激频率达到64Hz时钩状纤维和套索纤维均出现最大程度的舒张反应。2河豚毒素可以明显降低EFS引起的人食管下括约肌频率依赖性舒张反应,表明EFS诱导的舒张反应是神经源性的。3 EFS诱导产生的人食管下括约肌频率依赖性舒张可能有5-HT4受体参与,可能没有5-HT3受体和5-HT7受体的参与。