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目的：①构建表达TFPI-2的重组腺病毒（AdTFPI-2），并鉴定其在肝癌细胞Hep3B的表达水平。②AdTFPI-2感染肝癌细胞Hep3B和HepG2，观察其对肝癌细胞诱导分化的作用。③应用iTRAQ技术筛选TFPI-2作用于肝癌细胞Hep3B后的差异蛋白，在Hep3B和HepG2细胞验证差异蛋白。④探讨TFPI-2诱导肝癌细胞分化的可能机制。 方法：⑴将pAdTrack-CMV与TFPI-2 cDNA片段经Kpn I、Xba I酶切后连接，获得质粒pAdTrack-CMV-TFPI-2，并测序验证目的基因序列的正确性。将Pme I酶切线性化的pAdTrack-CMV-TFPI-2与pAdEasy-1质粒共同转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组。Pac I酶切线性化的pAdTFPI-2转染293细胞包装病毒，获得AdTFPI-2，用同样方法制备空载病毒AdGFP。AdTFPI-2感染肝癌细胞Hep3B，RT-PCR和Western blot检测TFPI-2的表达。⑵病毒感染肝癌细胞Hep3B和HepG2， RT-PCR和Western blot检测TFPI-2的表达；Real-time PCR检测肝细胞相关功能基因和干细胞相关基因的表达；CCK-8法检测肝癌细胞的增殖情况；平板克隆形成实验观察单个肝癌细胞的增殖能力；流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率和CD133+细胞。⑶病毒感染肝癌细胞Hep3B72 h时收集细胞，提取蛋白；采用iTRAQ标记技术结合串联质谱分析方法，筛选TFPI-2作用于Hep3B细胞后的差异表达蛋白，同时用Protein Center软件对差异蛋白进行GO（Gene Ontology）功能注释分析；并用Western blot在Hep3B和HepG2验证部分差异表达蛋白。⑷AdTFPI-2感染肝癌细胞36 h后，经siPORT NeoFX分别转染siRNA-GSK3β和siRN-NC进肝癌细胞，从蛋白水平评价siRNA沉默细胞内GSK3β表达效率。qRT-PCR检测肝细胞相关功能基因和干细胞相关基因表达。 结果：①Kpn I、Xba I双酶切后琼脂糖凝胶电泳及测序表明，成功构建穿梭质粒pAdTrack-CMV-TFPI-2；经293A细胞包装、扩增获得了高滴度的AdTFPI-2；RT-PCR以及Western blot结果表明TFPI-2在转录和翻译水平的表达均明显增强。②实时定量RT-PCR结果表明，AdTFPI-2感染肝癌细胞后能增加APOCIII、PEPCK、ALDOB等肝细胞相关功能基因 mRNA表达；并且降低CD133、β-catenin、Klf4等干细胞相关基因 mRNA表达。与对照组相比，AdTFPI-2感染肝癌细胞后增殖能力受到抑制；流式细胞术检测结果表明TFPI-2表达后肝癌细胞凋亡率明显增加（Hep3B中:30.57％±1.25 VS10.19%±0.07, P<0.01; HepG2中:16.57%±0.63 VS9.24%±0.09, P<0.05），并且CD133+细胞明显减少（Hep3B中:57.69%±2.23 VS88.46%±1.25, P<0.01; HepG2中:41.64%±1.82 VS57.39%±1.17, P<0.05）。③在Hep3B-TFPI-2组和Hep3B-GFP组，共鉴定出1536种蛋白，差异蛋白163种，其中上调蛋白96种，下调67种蛋白；差异蛋白主要分子学功能为DNA结合、转录因子活、蛋白结合、催化活性等，参与的生物学进程为细胞交流、细胞分化、生物合成、代谢进程、生物学调节等；运用Western blot验证验证差异蛋白结果与蛋白组学变化趋势相同。Western blot结果显示 Wnt/β-catenin信号通路成员β-catenin表达降低， p-GSK3β和Axin1表达升高。实时定量RT-PCR结果显示Wnt/β-Catenin信号通路中DKK4和Axin1 mRNA表达水平明显上调，而β-catenin mRNA表达水平显著下调。结果提示TFPI-2可能通过抑制Wnt/β-Catenin信号转导通路而诱导肝癌细胞分化。④从蛋白水平发现，转染细胞后有效抑制siRNA-GSK3β转染肝癌细胞后有效抑制 p-GSK3β的表达， Western blot检测显示转染siRNA-GSK3β组的p-GSK3β蛋白相对表达量相较于对照组明显降低（Hep3B-TFPI-2中：0.124±0.006 VS0.679±0.037, P<0.01;HepG2-TFPI-2中：0.096±0.007 VS0.732±0.009, P<0.01)。siRNA-GSK3β能抑制TFPI-2对肝癌细胞的诱导分化作用。转染 siRNA-GSK3β后Hep3B-TFPI-2细胞的肝细胞功能基因表达明显下调，包括ApoCⅢ、PEPCK、ALDOB、BR、GYS2（下调比例分别为0.613±0.046、0.537±0.078、0.677±0.052、0.584±0.051和0.646±0.031）；同样在HepG2-TFPI-2细胞中，ALDOB、HPD、APOAI、BR、GS、GYS2表达也下调（下调分别为0.537±0.013、0.449±0.048、0.626±0.047、0.362±0.034、0.378±0.009和0.403±0.057）。转染siRNA-GSK3β组和转染siRNA-NC组比较，Hep3B-TFPI-2细胞和HepG2-TFPI-2细胞增殖明显受到抑制（P<0.01）。 结论：⑴成功构建AdTFPI-2重组腺病毒，其可高效感染肝癌细胞Hep3B和HepG2，并能在细胞内维持TFPI-2高效表达。⑵TFPI-2可诱导肝癌细胞向肝细胞方向分化，并使与发育、代谢以及信号转导相关的蛋白差异表达。⑶TFPI-2可能通过抑制Wnt/β-Catenin信号转导通路而诱导肝癌细胞分化。