研究背景:干细胞研究是再生医学的重要组成部分,研究干细胞的最终目的是应用干细胞治疗疾病。诱导多能型干细胞(iPSc)是由体细胞诱导分化而成的“多能细胞”,具备和胚胎干细胞(ESCs)类似的功能,既解决了ESCs的伦理障碍,又为ESCs的获得提供了一条全新的途径,具有重要的理论和应用价值。神经干细胞移植治疗帕金森病是目前公认的最有前景的治疗方案。在低氧条件下转基因培养的神经干细胞,能高效地诱导分化为多巴胺能神经元,为移植治疗帕金森病提供细胞源。目的:(1)建立猪成纤维细胞系和神经干细胞系并进行生物学特征检测。(2)初步建立以猪自身特异再程序化因子iPS细胞系的实验体系。方法:本实验首先以新生猪为实验动物,建立成纤维细胞系和神经干细胞系。继而通过建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统,对上海斯丹赛生物技术有限公司iPS细胞诱导慢病毒四质粒系统进行改造,用猪自身再程序化因子进行替代,进一步利用慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入猪成纤维细胞,构建携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因高效率感染的病毒载体,进而将其在体外诱导为iPS细胞。结果:(1)猪成纤维细胞系的创建:构建22个个体猪成纤维细胞系,并对其遗传特征及细胞系的生物学品质进行检测。为保证其遗传学稳定性,体外传代次数少于4代。通过细胞形态学观察、细菌、真菌、支原体检测、生长曲线与核型分析等多项细胞系质量检测,结果表明建立的猪成纤维细胞系遗传性质稳定。利用6种荧光蛋白基因在所建细胞系中得到良好的表达,说明细胞具有良好的被转染能力,为进行猪特色功能基因的表达、定位和克隆化细胞的筛选奠定了基础。(2)神经干细胞系的创建:建立以新生猪大脑皮层为来源的NSC细胞系,利用体外培养技术进行培养、冻存和复苏实验。所获得的猪NSC呈典型的神经球生长,并表达神经干细胞特异性基因巢蛋白(Nestin),符合神经干细胞的特性。诱导7d后,细胞具备分化为神经元细胞及神经胶质细胞的能力。我们对NSC分离培养的方法、细胞生物学特性以及影响其分离与增殖的因素进行探索,为神经干细胞在医学领域中的应用奠定了基础。(3)iPS细胞系的诱导:借助慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因转染导入293FT细胞,并进行重组病毒的包装与滴度测定,进而利用重组病毒感染新生猪神经干细胞在体外诱导,获得i PS细胞系,并对获得iPS细胞进行SSEA-1,SSEA-3与TRA-80-1表面抗原、标记基因鉴定。结论:(1)成功建立了猪成纤维细胞系,并进行了遗传特征与生物学特征检测,为猪iPS细胞的诱导提供了实验材料。(2)从新生猪大脑皮层中分离组织,制成单细胞悬液,利用机械法和酶消化法相结合的方法培养。鉴定培养出的神经球证明其具有神经干细胞的生物学特性。冻存后重新复苏细胞进行培养,并进行一系列鉴定神经干细胞生物学特性的相关实验,得出其仍具有NSC的特性。(3)针对猪成纤维细胞系与神经干细胞建立了慢病毒介导的体外感染体系,成功构建了携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因高效感染的病毒载体,利用重组病毒感染新生猪神经干细胞在体外诱导,获得了N-iPS细胞系,为猪的iPS细胞开展实验动物模型移植治疗奠定基础。