细胞凋亡指由基因控制的细胞自主有序的死亡,它涉及一系列基因的激活、表达和调控的改变。心肌细胞是终末分化细胞,增殖能力极弱,在胚胎期后期,其数量就几乎不再增长。凋亡和坏死是心肌细胞数量减少的最主要原因,心肌数量减少后难以恢复,进而逐步降低心肌细胞的功能,形成心衰等症状。鸡的不少疾病病程中也伴随着明显的心肌细胞凋亡和损伤,心肌细胞的凋亡甚至成为某些疾病的始动因素,如腹水综合征等疾病。因此,凋亡在鸡心肌细胞中占有非常重要的地位。转录组测序可以将特定细胞在某一状态下所能转录出来的所有RNA,包括mRNA和非编码RNA全部高通量测序。它是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息,并忠实反映出细胞内所有基因表达的变化。目前,哺乳动物心肌细胞凋亡的研究已经比较充分,近年来,已经发现了越来越多的凋亡或凋亡阻抑分子,发掘了大量的凋亡信号通路,其作用机理也研究得比较充分。但鸡心肌细胞凋亡的相关研究开展较少,其很多重要分子没有被发现,凋亡通路也没有完善,其具体的凋亡和凋亡阻抑也不能直接套用哺乳动物的研究结果。根据转录组测序技术的特性,将可以一站式的解决这些问题。为了补充上述鸡心肌细胞凋亡研究方面的不足,理清鸡心肌细胞凋亡中的各个环节,找出其具体的凋亡通路,构建凋亡的蛋白互作网络,开展了以下的试验研究:1.鸡心肌原代细胞培养鉴定与凋亡诱导试验为建立鸡心肌原代细胞培养模型和获得稳定、高纯度的鸡心肌原代细胞,并初步探讨凋亡诱导条件,采用14d白来航鸡胚,细致分离其心室肌,剪碎,0.05%胰酶消化,吹打,离心收获细胞,接种于T25细胞培养瓶,30min差速贴壁转接24孔板,6 h后洗涤1次,培养的细胞进行形态学观察、免疫组化检测鉴定和肌球蛋白PCR鉴定。获得的细胞用0.1-1.6 mM梯度过氧化氢诱导凋亡,检测凋亡出现的时间和凋亡基因表达的变化,结果显示胰酶消化法可以获得很高纯度的心肌细胞,细胞呈大三角形,持续培养下具有多形性。a-actin免疫组化鉴定为阳性,肌球蛋白PCR鉴定阳性,细胞可以稳定生长15天以上。在0.2 mM过氧化氢诱导下,经过9 h,鸡心肌原代细胞发生明显细胞凋亡,凋亡相关基因的表达达到峰值,可用于后期凋亡诱导试验。2.转录组测序鉴定过氧化氢诱导的鸡心肌细胞凋亡应答为了解鸡心肌细胞凋亡下各种应答、建立凋亡相关通路,培养鸡心肌原代细胞,诱导心肌细胞凋亡,提取RNA并进行该心肌细胞全转录本测序,并与正常组进行对比。通过RNAseq,我们总共发现19268个转录本和2160个新基因,而在凋亡进程中,总共有6148基因发生明显差异表达,其中14.5%的表达上调和17.5%的表达下调。通过对测序分析,总共富集了152条信号通路,其中,绝对多数是合成和代谢相关的通路,但也有一些直接是凋亡信号通路。合成和代谢相关的通路主要包括:“脂肪酸代谢”、“丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸的代谢”、“不饱和脂肪酸生物合成”、“内质网蛋白加工”等,和凋亡直接相关的信号通路的激活主要包括:“PPAR信号通路”、“脂肪细胞因子信号通路”、“TGF-beta信号通路”、“Toll样受体信号通路”、“MAPK信号通路”、“p53信号通路”和“Wnt信号通路”。除了这两大类通路以外,我们发现,其他一些通路也明显被激活,如“Regulation of actin cytoskeleton”和“cell cycle”。从通路筛选的情况来看,过氧化氢诱导不仅仅形成了凋亡,而且过氧化氢的细胞毒性也明显影响了细胞的各种功能活动、生物合成和代谢以及细胞的运动、细胞周期等,因此,过氧化氢诱导的凋亡应该是一个很广泛的基因调动和多方面应答的过程。以caspase家族基因在凋亡中的作用,以及凋亡阻抑可能涉及到的基因来评估鸡心肌细胞对该种凋亡诱导的应答反应。结果显示凋亡的启动在鸡心肌细胞中主要依赖于caspase8和9,而凋亡的效应则主要依赖于caspase-3。凋亡阻抑在过氧化氢诱导的凋亡中主要依赖于API5和TRIA1。