本文以砷甲基化酶和缺氧诱导因子脯氨酸羟化酶为研究对象，对它们的表达和催化活性进行了深入的研究。围绕上述研究主线，我们制备了砷甲基化酶及其四个突变体，运用谱学和HPLC-ICP-MS研究了它们的结构与功能的关系以及硒对甲基化酶结构和功能的影响；同时制备了脯氨酸羟化酶并运用HPLC和MALDI-TOF-MS研究了两个多氮化合物对其活性的影响，探讨了小分子抑制剂对脯氨酸羟化酶抑制的可能机理。主要工作如下：　　 (1)根据GenBank公布的人砷甲基化酶核酸序列AK057833，设计一对引物，标准RNA分离法从人肝癌细胞HepG2中提取总RNA作为RT-PCR模板扩增甲基化酶全长基因。利用定点突变技术改造甲基化酶基因中一个稳定的发卡结构，改造后的基因克隆pMD18-T载体并经双脱氧法测序验证。甲基化酶基因连接pET32a载体构建重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS宿主菌，IPTG低温诱导表达。甲基化酶经亲和层析纯化，SDS-PAGE、Western-blot、紫外-可见光光谱、圆二色光谱、荧光光谱和MALDI-TOF-MS质谱表征。运用HPLC-ICP-MS研究了甲基化酶的活性，并对甲基化酶酶促动力学进行了研究，优化了甲基化反应的最佳条件，考察了不同还原剂对甲基化反应的影响。初步探讨了甲基化酶的转化途径。　　 (2)首次运用谱学(紫外可见光光谱，圆二色光谱和荧光光谱)研究SeⅣ和甲基化酶相互作用及其对甲基化酶结构和功能关系的影响。随着SeⅣ浓度的增加，甲基化酶的紫外吸收强度增加，产生增色效应，并发生微弱的蓝移(2 nm)。甲基化酶的CD谱图在195 nm处有一正峰，在208 nm和222 nm处分别有一负峰，根据yang.Jwr方法计算出甲基化酶的二级结构参数为29.0％α螺旋，23.9％β折叠，17.9％β转角以及29.2％无规卷曲。随着SeⅣ浓度的增加，甲基化酶CD谱中正峰和两个负峰的强度逐渐降低，其中正峰(195 nm)降低35.54％，负峰(208nm)降低35.54％，负峰(222 nm)降低35.94％，甲基化酶的二级结构中的α螺旋含量不变，但是β折叠显著增加。甲基化酶的荧光随着SeⅣ的不断加入逐渐猝灭。我们推测SeⅣ结合半胱氨酸的巯基引起甲基化酶的结构改变从而导致紫外吸收强度增加和色氨酸残基的荧光被邻近的质子化的天冬氨酸或谷氨酸的侧链上的羧基猝灭。SeⅣ对甲基化酶活性的抑制具有浓度依赖性，SeⅣ的半抑制浓度(IC50)为2.38μM，Ki值为2.61μM。抑制动力学研究表明随着SeⅣ浓度的增加，Km值不变，Vmax值降低，为非竞争性抑制。因此可以推测SeⅣ可能与人甲基化酶结构残基中的一个或多个半胱氨酸相互作用，而不是与活性中心的半胱氨酸残基结合，Cys72和或Cys226可能是SeⅣ首选结合位点。　　 (3)半胱氨酸对甲基化酶的结构和功能都具有重要的作用。运用定点突变的方法扩增了四个甲基化酶突变体基因(C156S，C206S，C226S和C250S)，采用pET32a-大肠杆菌表达系统低温诱导表达四个甲基化酶突变体基因。甲基化酶突变体蛋白经亲和层析纯化，圆二色光谱表征。活性研究表明C156S，C206S和C250S均失去甲基化功能；C226S和母体甲基化酶具有相似的活性，Km和Vmax基本上一致。蛋白质序列比对分析表明Cys156和Cys206和鼠甲基化酶的Cys157和Cys207高度保守，Cys157和Cys207是鼠甲基化酶活性位点，故Cys156和Cys206从遗传和功能上讲属于人甲基化酶的活性位点，而Cys250可能为甲基化酶的另一个活性位点或者是结构性残基中重要的氨基酸。比较甲基化酶母体和突变体二级结构参数发现，C226S的二级结构和母体甲基化酶一致，而C156S，C206S和C250S的二级结构发生了很大的变化，尤其是C250S的β-折叠。Cys156，Cys206和Cys250在甲基化酶的结构和功能上起着重要的作用，当156，206和250位置上的半胱氨酸突变成丝氨酸时，甲基化酶的空间结构发生改变从而引起甲基化酶的活性丧失。　　 (4)根据大肠杆菌密码子的偏好性对脯氨酸羟化酶基因进行了改造和人工合成，并在大肠杆菌中获得高效表达。脯氨酸羟化酶经亲和层析纯化，SDS-PAGE、western-blot和质谱表征。在体外运用HIF-1α19肽作为底物进行了活性研究，并优化了羟化反应的条件，确定了几种辅因子的最优化浓度。脯氨酸羟化酶的Km值为0.235 m mol/L，Vmax为1.475μmol/(mg h)。HIF-1α19肽和羟化产物运用高效液相色谱分离并通过MALDI-TOF-MS鉴定。羟化产物和HIF-1α19肽的保留时间分别为28.6 min，29.1 min，HIF-1α19肽分子量为2277(M+Na+)，羟化产物的分子量为2293，羟化产物分子量增加了16，表明HIF-1α19肽中脯氨酸残基变成了羟脯氨酸。脯氨酸羟化酶是亚铁离子和2-酮戊二酸依赖性羟化酶，Fe2+在羟化反应中起着重要的作用。我们选择多氮化合物1和2来研究它们对脯氨酸羟化酶的活性的影响。结果显示，多氮化合物1和2对脯氨酸羟化酶的抑制具有浓度依赖性，半抑制浓度分别为15.4，29.4μM。抑制动力学表明多氮化合物1和2对脯氨酸羟化酶的抑制作用是非竞争性的，Ki值分别为20.5，45.8μM。多氮化合物1和2作为Fe的螯合剂降低了羟化反应体系中Fe2+的含量，使羟化反应受到抑制。　　 本论文的创新之处在于：　　 (1)运用大肠杆菌密码子偏好性改造了砷甲基化酶和脯氨酸羟化酶基因并通过大肠杆菌进行低温诱导表达。　　 (2)首次运用谱学的方法表征了砷甲基化酶的二级结构，研究了硒对砷甲基化酶结构与功能的影响，初步推测了硒与砷甲基化酶结合位点。　　 (3)运用定点突变的方法获得了四个砷甲基化酶突变体，结合圆二色光谱和HPLC-ICP-MS技术研究了砷甲基化酶结构和功能的关系，确定了砷甲基化酶的两个活性位点Cys156和Cys206，并发现Cys250在空间结构中起着非常重要的作用。　　 (4)运用HPLC和MALDI-TOF-MS技术研究了大环多胺类化合物对脯氨酸羟化酶活性的影响，开辟了不同于2-酮戊二酸类似物的小分子抑制剂的研究。