癌细胞在致癌转化过程要经历新陈代谢方面的改变,从而满足细胞对代谢和生物合成的更高需求。正常细胞在有氧环境中主要依靠氧化磷酸化途径提供能量,但癌细胞在氧气存在下利用糖酵解代谢方式供能,导致一些肿瘤中出现氧化磷酸化活性降低。在氧化磷酸化过程中,电子传输链复合物将电子转移给氧分子,产生质子梯度,由H+-ATP合酶介导ATP合成。H+-ATP合酶F1结构域β亚基(H+transporting F1 complex beta subunit of mitochondrial ATP synthase,ATP5B)是H+-ATP合酶的催化亚基,参与调控线粒体的生物能和死亡信号转导功能。有研究表明PI3K-AKT通路参与癌细胞代谢,该通路在肿瘤中通常呈现过度激活状态。细胞膜上的PI3K可被多种酪氨酸激酶受体激活,进而启动信号传导,调控细胞的增殖、侵袭和凋亡。结直肠癌是全球第三大常见的恶性肿瘤,其发展机制一直是研究的重点。以往的研究中ATP5B在结直肠癌中的表达水平存在争议,其在结直肠癌中的作用机制尚未充分阐明。本研究通过人群、组织、细胞三个水平验证ATP5B与结直肠癌的关系。利用生物信息学分析和meta分析研究ATP5B在肿瘤中的差异表达和其表达水平与患者预后的关联性;研究结直肠癌组织和癌旁组织中ATP5B的表达水平及其与临床病理参数和患者预后的关联性;研究ATP5B表达水平对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡功能的影响,以及EGFR-PI3K-AKT信号通路对这些生物学行为的调控作用。方法:1.利用Oncomine和Timer数据库分析ATP5B在结直肠癌组织和正常组织中的差异表达;利用cBioPortal数据库和Cytoscape分析ATP5B在结直肠癌中的共表达基因和相关通路;利用PrognoScan数据库分析ATP5B表达水平与结直肠癌患者预后的关系。2.在线数据库检索ATP5B表达水平与实体瘤患者预后总生存期相关的文献,采用meta分析方法探究ATP5B表达水平与实体瘤患者预后的关联性。纳入的研究结合PrognoScan数据库中结直肠癌患者预后的生存信息,采用meta分析方法探究ATP5B表达水平与结直肠癌患者预后的关联性。3.RT-qPCR法检测10对结直肠癌组织和癌旁组织中ATP5B的基因表达情况。免疫组化方法检测41对人结直肠癌组织和癌旁组织中ATP5B的蛋白表达情况,分析ATP5B表达水平与临床病理参数的相关性。Kaplan-Meier生存分析及Cox多因素分析ATP5B表达与患者预后的关系。4.采用脂质体转染方法在结肠癌SW1116和Lovo细胞系中构建ATP5B过表达和敲低表达细胞系,用荧光显微镜观察过表达细胞转染效率,利用RT-qPCR法和western blot法在基因水平和蛋白质水平检测转染效果。利用CCK8法检测ATP5B的表达与细胞增殖能力的关系;利用细胞划痕实验和transwell实验检测ATP5B的表达与细胞迁移能力和侵袭能力的关系;应用流式细胞仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;细胞经Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察细胞核的形态判断凋亡情况,并应用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例。5.利用western blot法检测ATP5B过表达和敲低表达细胞系中凋亡相关蛋白 Bcl2 和 Bax 以及 EGFR-PI3K-AKT 信号通路中 EGFR、pEGFR、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT和PTEN的蛋白表达水平。结果:1.Oncomine和Timer数据库分析显示ATP5B在结直肠癌组织中较正常组织下调表达。GO和KEGG功能分析结果表明ATP5B主要与外源化合物的转运、一元羧酸的转运和磷脂的易位等功能相关联。PrognoScan数据库分析结果发现ATP5B表达水平与患者总生存期无明显关联性,但是ATP5B高表达的患者完全缓解无病生存期更长。2.ATP5B表达水平与实体瘤患者预后的meta分析中纳入1,458名患者,合并meta分析结果提示ATP5B表达水平与实体瘤患者预后总生存期无显著关联性(HR=1.85,95%CI:0.85-4.02)。在对结直肠癌患者完全缓解无病生存期的meta分析中发现ATP5B高表达是预后的保护因素(HR=0.42,95%CI:0.22-0.82),但是ATP5B表达水平与结直肠癌患者总生存期无显著关联性(HR=0.80,95%CI:0.54-1.19)。3.RT-qPCR结果表明ATP5B在结直肠癌组织中下调表达。免疫组化结果显示ATP5B主要在胞浆中表达,ATP5B在结直肠癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。在对ATP5B与患者临床病理参数的研究中我们发现ATP5B的下调表达与TNM分期和淋巴结转移相关;与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化水平无显著相关性。Kaplan-Meier生存分析结果提示ATP5B高表达的结直肠癌患者预后总生存期更长,但Cox多因素分析结果显示ATP5B不是预后的独立预测因子。4.通过脂质体转染成功构建瞬时转染ATP5B过表达和敲低表达的SW1116细胞系和Lovo细胞系。CCK8法检测发现过表达ATP5B抑制细胞的增殖;细胞划痕实验和transwell实验结果显示过表达ATP5B抑制细胞的迁移和侵袭能力;Hoechst33258染色结果发现过表达ATP5B的细胞出现了明显核碎裂浓染,流式细胞仪检测细胞内ROS水平和凋亡细胞数量,实验结果提示过表达ATP5B促进ROS生成和细胞凋亡。在过表达ATP5B组加入PI3K激活剂740Y-P可逆转ATP5B对细胞增殖和迁移的抑制以及对细胞凋亡的促进作用。然而,敲低表达ATP5B促进细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞内ROS生成和凋亡。5.Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达,ATP5B过表达组细胞内Bc12/Bax的比值较对照组显著降低,但是加入PI3K激活剂740Y-P后Bc12/Bax的比值较过表达组升高。EGFR-PI3K-AKT通路相关蛋白的表达结果显示ATP5B过表达抑制pEGFR、pPI3K、pAKT的表达并且促进PTEN的表达,但对EGFR、PI3K和AKT的蛋白表达无显著影响,加入740Y-P后可逆转ATP5B对pPI3K、pAKT和PTEN表达的调控。然而,敲低表达ATP5B的细胞内Bc12/Bax的比值较对照组升高。同时,细胞内pEGFR、pPI3K和pAKT的表达水平升高,PTEN的表达水平降低。结论:1.ATP5B在结直肠癌组织中下调表达,其下调表达与TNM分期和淋巴结转移相关联。2.ATP5B下调表达是结直肠癌患者预后的危险因素,ATP5B可能成为结直肠癌患者预后的标志物。3.ATP5B抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞内ROS的生成和细胞凋亡。4.EGFR-PI3K-AKT信号通路参与ATP5B对结肠癌细胞生物学功能的调控。