光与化学小分子共同控制的基因表达系统

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精确调控基因表达对于研究细胞的迁移、增殖、分化、衰老、死亡等各类生命活动至关重要。基于光和化学小分子共同调控的基因表达系统可能会同时具有化学诱导系统和光诱导系统的优点,为生命研究提高更有价值的工具。然而到目前为止,这样的系统鲜有报道。  CarH蛋白在脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl)存在以及黑暗条件下可以形成同源四聚体,进而特异性结合CarO序列。在AdoCbl不存在或光照条件下,CarH蛋白以单体的形式存在,不能结合CarO序列。基于这样的原理,我们首先利用CarH蛋白调控野生型启动子PCarO或含CarO序列的嵌合启动子在大肠杆菌中的活性。实验结果表明,在AdoCbl存在以及黑暗条件下,CarH蛋白可以形成同源四聚体结合到启动子的CarO序列上,阻碍RNA聚合酶与启动子的结合,基因表达关闭;在AdoCbl不存在或光照条件下,单体CarH不能结合启动子抑制其活性,基因表达开启。这种基于光和AdoCbl共调控的的光激活基因表达系统有近40倍诱导倍数,且有很好的温度普适性、光强依赖性以及高空间分辨率。我们接下来将CarH蛋白的N端DNA识别结合结构域更换为大肠杆菌LexA408阻遏蛋白的DNA识别结合结构域。实验结果表明LexA408-CarH同样可以在光和AdoCbl的调控下与含LexAop408序列的启动子结合,进而调控其活性。该系统的诱导倍数可达近200倍,并且也具有很好的温度普适性、光强依赖性、快速响应动力学以及高空间分辨率。  在本研究中,我们还将CarH蛋白与p65转录激活域融合获得CarH-p65融合蛋白。实验结果表明光和AdoCbl可以调控CarH-p65与哺乳动物细胞最小启动子上游的CarO序列结合,进而调控下游基因的转录与表达。这种基于光和AdoCbl共调控的哺乳动物细胞基因表达系统有着近200倍的诱导倍数、很好的AdoCbl浓度和光强依赖性以及高时空分辨率。  本研究开发的基于光和AdoCbl共调控的原核细胞和真核细胞基因表达系统具有很好的诱导特性,将会为合成生物学、光遗传学提供有力工具,并将广泛用于生命科学的各研究领域中。
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