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第一部分：Kupffer细胞及IL-1β与患者NAFLD进展的关系目的：比较单纯性脂肪肝(NAFL)与脂肪性肝炎(NASH)患者的临床血清学指标及组织病理学结果,初步探讨Kupffer细胞(KCs)及IL-1β与NASH发生的关系。方法：根据NAFLD纳入及排除标准,收集高度怀疑或术前影像学诊断为NAFLD患者的肝脏标本,首先制作石蜡切片进行HE染色,通过NAFLD活动度评分标准将患者分为正常组、NAFL组及NASH组,其次比较各组患者血清转氨酶、甘油三酯、游离脂肪酸(FFA)及IL-1β的水平,最后通过F4/80免疫组化及天狼星红染色法,观察各组肝组织中KCs的聚集情况及胶原纤维的增生情况。结果：(1)本次共收集8例肝脏标本,经NAS评分诊断NASH3例,NAFL3例,正常肝脏2例。(2)正常组及NAFL组患者血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯、FFA水平均在正常范围内,血清IL-1β低于检测下限。NASH组患者血清ALT、AST及甘油三脂均在正常参考值范围,FFA及IL-1p水平高于正常组及NAFL组(P<0.05)。(3) NAFL及NASH肝组织F4/80表达阳性细胞(KCs)较正常肝脏组织明显增多,在肝细胞脂肪变的区域KCs聚集较多；天狼星红染色结果显示NASH组肝组织胶原纤维增生程度较NAFL及正常肝脏组无明显增加。结论：血清FFA、KCs及促炎因子IL-1β可能参与人体NAFL向NASH的发展。第二部分：抑制TXNIP与NLRP3基因的表达对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体信号通路的影响目的：观察敲除小鼠硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因与NLRP3基因对FFA激活NLRP3炎症小体及促进促炎因子IL-1p分泌的影响,探讨FFA激活NLRP3炎症小体的具体机制。方法：取野生型(WT) C57BL/6小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠,采用肝脏在体PBS灌注,离体胶原酶消化、梯度离心联合选择性贴壁法分离各组小鼠KCs, F4/80免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定KCs的纯度,吞墨实验判断KCs的吞噬功能,光镜下动态观察KCs随时间的形态变化。将分离培养48 h的KCs以2-3×106密度接种于T25细胞培养瓶及激光共聚焦培养皿中,并随机分为2组：①FFA组(FFA Group):给予浓度为0.3 mM的棕榈酸(Palmitic acid, PA)刺激；②对照组(CONGroup):不给予任何刺激。于处理后8h收获细胞。光镜及透射电镜观察KCs的形态变化,荧光实时定量PCR(Q-PCR)检测TXNE、NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表达变化,Western blotting检测TXND、 NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平,激光共聚焦检测TXNIP、 NLRP3及Caspase-1的表达情况,ELISA法测定KCs培养上清液中IL-1β水平。结果：(1)免疫荧光染色可见KCs细胞膜高表达F4/80分子,提取的KCs纯度大于90%,吞墨实验可见KCs吞噬大量碳素颗粒。(2)FFA组与CON组KCs光镜下形态无明显差异,透射电镜下可见FFA组KCs吞噬大量脂滴。(3)WT小鼠FFA组与CON组TXNIP.ASC及Caspase-1的mRNA表达量无显著性差异(P>0.05),FFA组NLRP3的mRNA表达水平略高于CON组(P<0.05),NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP、ASC及Caspase-1的mRNA表达量高于CON组(P<0.05),TXNTP-/-小鼠FFA组NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA表达量较CON组显著增高(P<0.01)。(4)WT小鼠FFA组TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达量较CON组明显增高(P<0.05),NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP、ASC及Caspase-1的蛋白表达量与CON组相比无显著性差异(P>0.05),TXNIP-/-小鼠FFA组NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达量较CON组显著增高(P<0.05)。(5)激光共聚焦结果示WT小鼠FFA组KCs中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的荧光强度较CON组明显增高,TXNIP-/-.小鼠FFA组NLRP3及Caspase-1的荧光强度较CON组亦明显升高,NLRP3-/-小鼠FFA组TXNIP及Caspase-1的荧光强度较CON组仅轻度升高。(6)WT及TXNIP-/-小鼠FFA组细胞培养上清液中IL-1β的水平较CON组明显增高(P<0.05),NLRP3-/-小鼠FFA组IL-1β的水平较CON组仅轻度增高,两组比较无明显差异(P>0.05)。结论:FFA可激活WT及TXNIP-/-小鼠KCs中NLRP3炎症小体,促进KCs分泌IL-1β,敲除小鼠NLRP3基因后可明显抑制FFA刺激导致的KCs中NLRP3炎症小体的激活及IL-1β的分泌。第三部分：抑制TXNIP与NLRP3基因的表达对小鼠单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎形成的影响目的：通过建立NAFL与NASH小鼠模型,探讨TXNIP与NLRP3炎症小体在小鼠NAFL与NASH形成过程中的作用。方法：分别用普通饲料(ND)及蛋氨酸胆碱缺乏的饲料(MCD)饲料喂养WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠四周,用高脂饲料(HFD)喂养WT小鼠、TXNIP-/-小鼠及NLRP3-/-小鼠八周。每周称小鼠体重,喂养结束后称肝脏重量,检测小鼠血清中转氨酶、FFA及IL-1β的水平,苏木素伊红染色法(HE染色)及油红染色法观察肝组织病理变化,透射电镜观察WT小鼠肝组织的形态变化,免疫组织化学法观察F4/80在肝组织中的表达情况,激光共聚焦检测肝组织中TXNIP、NLRP3及Caspase-1的表达情况。提取各组小鼠KCs,Western blotting检测TXNIP、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白表达水平,免疫共沉淀技术检测TXNIP、 NLRP3、ASC及Caspase-1的相互作用情况。结果：(1)WT小鼠、NLRP3-/-小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组血清ALT及AST较ND组明显增高(P<0.05),HFD组较ND组仅轻度增高,无显著性差异(P>0.05)；WT小鼠HFD组与MCD组血清FFA水平较ND组明显增高(P<0.05),NLRP3-/-小鼠与TXNIP-/-小鼠各组血清中FFA水平无显著性差异(P>0.05)；WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组血清IL-1β水平明显高于ND组及HFD组(P<0.01),NLRP3-/-小鼠MCD组血清IL-1p水平较ND组及HFD组仅轻度增高,差异亦具有统计学意义(P<0.05)。(2)WT小鼠及TXNIP-/-小鼠HE染色及油红染色示HFD组NAFL形成,肝细胞有脂肪变,炎症不明显,气球样变少见,MCD组NASH形成,肝细胞有点状坏死,有较多炎症细胞浸润,MCD组肝脏F4/80表达阳性细胞(KCs)较ND组及HFD组明显增多。WT小鼠肝组织透射电镜结果示MCD组肝细胞肿胀,胞浆内有较多脂滴,伴有肝细胞坏死,部分肝血窦被破坏,红细胞进入肝细胞间隙。NLRP3-/-小鼠HFD组亦有NAFL形成,肝细胞脂肪变,肝血窦压缩变窄,炎症细胞浸润较少,MCD组肝细胞坏死及炎症程度较轻,未形成典型NASH,MCD组肝脏F4/80表达阳性细胞(KCs)与HFD组相比无明显增多。(3)肝组织激光共聚焦结果示WT小鼠MCD组TXNIP.NLRP3及Caspase-1的表达水平较ND组明显增高,TXNIP-/-小鼠MCD组NLRP3及Caspase-1的表达水平较ND组亦明显增高,NLRP3-/-小鼠MCD组TXNIP及Caspase-1的表达水平较ND组仅轻度增高。(4)Westem blotting结果示WT小鼠及TXNIP-/-小鼠MCD组KCs中NLRP3.ASC及Caspase-1蛋白表达水平较ND组及HFD组明显增高(P<0.05),ND组与HFD组之间无显著性差异(P>0.05)。NLRP3-/-小鼠MCD组ASC及Caspase-1的蛋白表达量与ND组及HFD组相比无显著性差异(P>0.05)。(5)免疫共沉淀结果示WT小鼠MCD组KCs中NLRP3炎症小体共聚体的量较ND组及HFD组明显增多(P<0.05),ND组及HFD组间无显著性差异(P>0.05),KCs中TXNIP亦可与NLRP3形成共聚体,MCD组TXNIP的表达量较ND组及HFD组仅轻度增加,比较无显著性差异(P>0.05)；TXNIP-/-小鼠MCD组KCs中仍可形成NLRP3炎症小体共聚体,共聚体的量较ND组明显增多(P<0.05)；NLRP3-/-小鼠MCD组KCs中仍有少量ASC-Caspase-1共聚体形成,共聚体的量较ND组仅轻度增加(P>0.05)。结论：FFA可通过激活KCs中NLRP3炎症小体,促进KCs分泌IL-1p,诱导WT小鼠NASH形成,敲除小鼠TXNIP基因并不能阻止NASH的形成,敲除小鼠NLRP3基因可明显抑制KCs中NLRP3炎症小体的激活及IL-1β的分泌,阻止NAFL进展为NASH。