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原始卵泡库是雌性生殖的基础,它由原始卵泡构成。随着年龄的不断增长和卵泡的不断发育消耗,哺乳动物卵巢内的原始卵泡数目不断减少,生殖功能逐渐走向衰退。但是在老年或绝经女性的体内,尚有一定数目的原始卵泡处于静息状态。早前研究证明处于静息状态的原始卵泡可以在体外被药物激活以获得有功能的卵子并产生健康的后代。近几年来,关于间充质干细胞(MSC)在卵巢早衰的治疗研究中已经有了较大的进展。外泌体作为MSC发挥其功能的载体,是一类直径在50-150nm之间的,由各类细胞分泌的细胞外囊泡,其内部含有丰富的核酸和蛋白质等,能参与多种生物学过程并发挥调控作用。本研究应用小鼠卵巢体外培养和自然衰老小鼠模型来探讨人脐带间充质干细胞(HUCMSC)外泌体对原始卵泡激活的作用。首先,我们从新生儿的脐带中分离得到原代脐带间充质干细胞,并建立了细胞系,将其传代培养,通过多向诱导分化实验和流式细胞学检测表面分子标志对其进行鉴定。随后使用自行制备的去囊泡胎牛血清配制条件培养基对脐带MSC进行培养,收集脐带MSC的条件培养基,使用超速离心的方法分离外泌体,并用Western Blotting鉴定外泌体的阳性和阴性标志物。同时我们对提取的外泌体进行粒径分析,发现其主要直径分布在100±40nm的范围内,且在透射电镜下可以观察到明显的囊泡结构。我们选用了新生3天乳鼠的卵巢进行体外培养,加入HUCMSC外泌体进行处理,观察发现外泌体处理后大量卵细胞中Foxo3a出核,mTOR信号通路相关蛋白磷酸化程度升高,原始卵泡被大量激活。外泌体处理后培养5天的卵巢大于对照组,卵母细胞发育被促进。而加入mTOR信号通路抑制剂及外泌体摄取阻断药物肝素以后,原始卵泡的激活作用可被抑制。为了进一步评估脐带干细胞外泌体对卵泡发育的影响,我们将处理后的卵巢移植到手术摘除卵巢的受体鼠的肾被膜下,14天后取材观察发现外泌体处理组卵巢明显大于对照组,其中卵泡发育情况优于对照组。同时我们对部分移植受体鼠注射hCG后取卵,发现外泌体处理组卵巢获得的卵的数目多于对照组。对处理组MⅡ期卵母细胞进行β-tubulin染色,纺锤体排布未见异常,证明了该体外激活方法对卵母细胞质量无明显影响。为进一步探究HUCMSC来源外泌体在体内模型中激活原始卵泡的效果。我们对12月龄老年小鼠卵巢包囊内注射了外泌体,1个月后进行育性实验检测,注射外泌体的老年小鼠平均生仔数高于对照组,卵母细胞质量和生育功能也得到一定改善。综上所述,我们在体外和体内两种模型中证实人脐带间充质干细胞外泌体可以激活原始卵泡,寻找了一种新的生物来源的卵泡激活剂,为未来临床上治疗卵巢早衰方法的优化和发展提供了新的实验依据和理论基础。