研究背景异氟烷是一种广泛应用于临床的吸入麻醉药,虽然其具体作用机制还有待于进一步研究,目前普遍认为其主要通过激活(或增强)中枢神经系统内的γ-氨基丁酸A (GABAA)受体和甘氨酸(gly)受体的功能发挥作用。发育期神经系统正处于神经发生与突触形成的高峰时期,在此期间神经系统的生长分化易受到各种干扰因素的影响。由于全身麻醉药物以中枢神经系统作为其作用靶器官,因而近年来全身麻醉药对发育期神经系统的生长发育是否存在毒性作用正逐渐引起广泛关注。γ-氨基丁酸(GABA)是脑内最重要的抑制性神经递质之一,可分为GABAA、GABAB、GABAC等三种受体亚型。GABAA受体广泛分布于大脑皮层、丘脑内外侧膝状体、海马、杏仁、丘脑、黑质、导水管周围黑质和小脑,是一种配体门控的氯离子通道受体,主要介导突触后抑制从而发挥抗焦虑、镇静和抗惊厥作用。GABAA受体在出生时即有表达并具备功能,而GABAB、GABAC受体则在出生后7-14天才逐渐发育并具备功能。GABAA受体被激动后,由其门控的氯离子通道开放,其通道内Cl-流动的方向取决于细胞内外的Cl-浓度差。在中枢神经系统生长发育高峰期(胚胎晚期至出生后2周),未成熟神经元胞膜上Na+-K+-2Cl同向转运体NKCC1高度表达,随后表达逐渐降低,NKCC1可将一个Na+、一个K+和2Cl-转运入细胞内,造成神经元胞浆内Cl-浓度增加。而K+-Cl-同向转运体KCC2在此期间表达低,随着神经元的发育成熟表达明显增加。KCC2逆Cl-电化学梯度将K+-Cl-同向转运出细胞,致使成熟神经元内Cl-浓度逐渐降低。成熟神经元表达具有功能的AMPA受体,AMPA受体兴奋可以移开阻滞于NMDA受体上的Mg2+,从而使NMDA受体Ca2+通道开放而兴奋。而未成熟神经元胞膜上缺乏具有功能的AMPA受体,其胞膜表达的GABAA受体兴奋可使Cl-外流,细胞膜去极化,从而发挥与成熟神经元上AMPA受体功能相似的作用,使Mg2+从阻滞于NMDA受体的位置移开,致NMDA受体兴奋。因而与成熟神经元不同,在胚胎期和出生后早期,GABAA受体介导突触后兴奋效应,在神经元轴突的生长、神经元之间突触的形成以及神经元的可塑性方面起着十分重要的作用。海马的神经元环路通过长时程增强或长时程抑制表现出很强的可塑性,从而在学习和记忆的形成过程中发挥十分重要的作用。神经元环路的形成依赖于海马神经元神经突起的发育及神经元之间突触的形成。海马神经元存在自发的特异性的钙振荡,此种本能的特异性的钙振荡对发育期神经元神经突生长锥的迁移、神经突的生长分化、神经元之间突触联系的形成等都起着十分重要的作用。神经元胞体的钙振荡机制十分复杂。研究表明,钙振荡由细胞外的钙离子通过配体调控性钙通道(如NMDA受体)或者电压调控性钙通道(如L型钙通道)进入胞浆,诱导内质网释放钙离子使胞浆内钙离子浓度急剧短暂升高,而胞浆内升高的钙离子被位于内质网上的Ca2+-ATP酶等迅速吸收,或被位于胞浆膜上的Na+/Ca2+交换子或钙泵泵出胞浆,从而使胞浆钙离子浓度恢复正常水平。神经元钙振荡的振幅和频率与轴突的生长锥的移行速度呈负相关。生长锥移行的物质基础是细胞骨架的重建,而胞浆Ca2+浓度短暂而瞬间的增加对细胞骨架的重建起着十分重要的作用。生长锥暂停移行时可以形成大的微管环,当微管环碎裂展开时生长锥重新开始移行。生长锥重新启动生长移行需要动力微管和肌动蛋白丝之间相互作用。胞浆内的钙振荡通过作用于神经钙蛋白使肌动蛋白丝脱聚合化以保持微管环的稳定,从而抑制生长锥的移行。研究证实,使用L-型Ca2+通道阻滞剂消除神经元的钙振荡,可促进神经元轴突生长锥的生长移行；而增强钙振荡的振幅和频率则可减慢生长锥的移行速率。因此本研究拟通过离体培养原代海马神经元,从影响神经元钙振荡、神经元存活、神经元轴突生长分化等方面深入探讨吸入麻醉药异氟烷致发育期海马神经元的神经毒性。本研究检验了以下假说：(1)异氟烷可增强发育期海马神经元的钙振荡；(2)临床安全浓度的异氟烷在安全时间内使用并不导致发育期海马神经元凋亡；(3)临床安全浓度的异氟烷通过增强海马神经元的钙振荡抑制神经元轴突生长锥的移行。研究方法与结果1.离体培养海马神经元异氟烷干预模型的建立方法：取直径8.6cm培养皿,放置于一密闭的安放于37℃细胞培养箱内的培养舱中,培养舱上有进气口和出气口各一。进气口持续给予：(1)实验组：携带不同浓度异氟烷(0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%)的空气(95%)和二氧化碳(5%)的混合气体(在培养皿安放前先用含相应浓度异氟烷的气体预充培养舱20分钟)；(2)对照组：仅使用空气(95%)及二氧化碳(5%)混合气体干预组和无气体干预组。培养舱出气口以细管接通风处。培养皿内给予Neurobasel+B27 (98ml+2ml)细胞培养液80ml,分别于5 min、10min、15min、30min、60 min、120 min抽取细胞培养液样本,使用2次平衡顶空气相色谱法测量培养液中异氟烷浓度。于异氟烷干预后60 min、120 min抽取对照及实验组细胞培养液分别检测其pH、PO2、PCO2、HCO3-。结果：实验各组培养基内异氟烷浓度均于干预15 min达到平衡,培养液异氟烷浓度与干预异氟烷气体浓度呈线性相关,其线性相关方程为：Y=1.521X-0.0368。在干预60 min、120 min之后,实验及对照组之间细胞培养液pH、PO2、PCO2、HCO3-等差异均无显著性(P<0.05)。2.发育期海马神经元钙振荡的特点及机制方法：取胎龄18天或1日龄以内新生SD大鼠进行原代海马神经元培养,体外培养至第2-5d,用Fluo-4AM (4μM)孵育后在激光共聚焦显微镜下行钙成像检测。通过去除细胞培养基内的Mg2+或Ca2+,以及使用NMDA、NMDA受体阻滞剂MK801、GABAA受体激动剂蝇蕈醇(muscimol)及其拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline)、AMPA受体拮抗剂(CNQX)、L型钙通道阻滞剂Nicadipine等对发育期海马神经元进行干预以分析发育期海马神经元钙振荡的形成特点。结果：使用NMDA (100μM)干预或者去除细胞外培养液内的Mg2+可使神经元的钙振荡增强,将细胞外液还原则钙振荡逐渐恢复正常。NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801(40μM)可使海马神经元钙振荡的振幅和频率完全被抑制。而AMPA受体的非竞争性拮抗剂CNQX (100μM)则对发育期海马神经元钙振荡的振幅和频率无明显影响。用3mM的EGTA中和细胞培养基内的Ca2+可以使发育期海马神经元钙振荡完全抑制,而用K-B’s液更换无钙的培养基则可使神经元细胞的钙振荡恢复。GABAA受体的竞争性激动剂蝇蕈醇(30μM)可使发育期海马神经元钙振荡振幅与频率明显增强。相反,应用GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱(50μM)则可使发育期海马神经元钙振荡的振幅与频率降低。L型Ca2+通道阻滞剂尼卡地平(10μM),使发育期海马神经元钙振荡的振幅与频率明显降低。3.异氟烷对发育期海马神经元钙振荡的影响方法：将体外培养2-5天的发育期海马神经元用Fluo-4 AM (4μM)孵育后在激光共聚焦显微镜下行钙成像检测。分别使用0、0.25、0.5、0.75、1MAC饱和过的培养基对其进行干预。同时对1MAC干预的海马神经元配伍使用荷包牡丹碱、MK801和(或)尼卡地平,以观察它们联合作用对发育期海马神经元钙振荡的影响,并分析异氟烷影响发育期海马神经元钙振荡的机制。结果：在0.25-1MAC (1MAC=1.46vol%)范围内,异氟烷呈剂量依赖性增强发育期海马神经元的钙振荡。1MAC的异氟烷干预可使发育期海马神经元钙振荡的振幅(F/F0)从1.67±0.17增加到2.11±0.27,使其振荡频率从0.03±0.005Hz增加到0.04±0.007Hz。50μM浓度的荷包牡丹碱可以逆转1MAC异氟烷对发育期海马神经元钙振荡的增强作用。单独应用尼卡地平(10μM)无法使异氟烷增强的钙振荡完全消失,而复合使用MK-801 (40μM)则可使钙振荡完全抑制。4.异氟烷干预对发育期大鼠海马神经元凋亡率的影响方法：取胎龄18天或1日龄新生SD大鼠进行原代海马神经元培养,体外培养至48h。将培养的海马神经元随机分为异氟烷(0.25、0.5、0.75、1.0MAC)干预组和对照组。每组神经元在异氟烷干预后与一组对照组一起行MTT比色实验。在每个小孔内加入MTT (5mg/ml) 20μl后,放置在37℃细胞培养箱内继续孵育4小时,终止孵育后,用微量移液器吸弃培养孔内上清液。然后在每个小孔内加入DMSO150μl,振荡混匀15分钟使甲臜充分溶解。在酶联免疫检测仪上选择490nm波长测定96孔板中各孔光吸收值。以试验孔的光吸收均值比对照组光吸收均值表示实验组神经元存活率。同时应用Western Blot技术检测各组活化的Caspase-3的表达。结果：应用MTT比色法检测异氟烷干预后的海马神经元存活率发现,0.25、0.5、0.75MAC的异氟烷干预2-8h对发育期海马神经元的存活无显著影响；1MAC异氟烷干预2-6h对发育期海马神经元存活率同样无显著影响,而1MAC异氟烷干预8h则可致发育期海马神经元存活率显著降低(P<0.05)。而应用Western Blot检测活化Caspase-3表达表明,1MAC异氟烷干预8h致发育期海马神经元存活率降低是由于激活了神经元凋亡途径致活化Caspase-3表达增加所致。5.异氟烷对发育期大鼠海马神经元轴突生长分化的影响方法：将培养于蚀像盖玻片上的发育期海马神经元在37℃细胞培养箱内培养48h后,迅速在Nikon TE2000倒置荧光显微镜用0.7 NA Neofluor CF160镜头为其照相。然后将海马神经元安放于密闭培养舱中,用异氟烷(0、0.25、0.5、0.75、1MAC)分别干预2、4、6h,干预结束立即用新鲜培养基替换培养皿内培养基。均于原代神经元培养的第54h在显微镜下拍照。然后分别在神经元培养的第96h和144h为神经元拍照。神经元拍照所得照片用Image-Pro Plus 6.0软件处理,使用其测量长度工具测量轴突长度及分支。结果：离体培养的发育期原代海马神经元,在蚀像盖玻片上培育48h后,海马神经元胞体呈锥形,长出4个树突和一个较长的轴突,轴突末端可见比较明显的生长锥,培育96-144h小时后树突略有长长,而轴突生长明显并逐渐长出多个分支。使用临床相关浓度的异氟烷(0.25-1MAC)干预体外培养的发育期海马神经元结果表明：0.25、0.5MAC的异氟烷干预2-6h以及0.75、1.0MAC异氟烷干预2-4h对发育期海马神经元轴突形态学生长分化无显著影响,而0.75、1.0MAC异氟烷干预6h明显抑制发育期海马神经元轴突形态学的生长分化,使其轴突生长速度放缓,分支数目减少,轴突分支总长度减少。统计学分析计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 12.0软件进行数据处理,钙荧光强度、MTT比色实验中的细胞存活率、活化Caspase-3的表达、神经元轴突的生长等采用配对t检验,其余结果比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.通过应用二次顶空气相色谱法(GC)测定培养基内异氟烷浓度以构建离体培养原代海马神经元的异氟烷干预模型。2.通过离体原代海马神经元培养,使用胞浆内钙离子荧光染色剂Fluo-4 AM在激光共聚焦显微镜下观测其钙振荡变化,并分析其特点及机制,证实吸入麻醉药异氟烷通过兴奋GABAA受体而增强发育期海马神经元的钙振荡。3.通过研究临床相关浓度异氟烷对发育期大鼠海马神经元轴突生长分化的影响,证实临床浓度的异氟烷并不导致海马神经元凋亡,但可抑制轴突的生长分化。二、研究结论临床浓度的吸入麻醉药异氟烷通过兴奋GABAA受体增强发育期海马神经元的钙振荡,从而抑制海马神经元轴突的生长分化。