低温下节杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶催化效率及表达调控

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海藻糖-6-磷酸合成酶(OtsA)普遍存在于原核与真核生命体中,在抗逆与糖代谢中起着重要作用,对OtsA及其代谢调控的研究也是植物和微生物领域研究热点之一。为了进一步了解OtsA在微生物逆境胁迫下的作用及其所受到的调控,本研究选用放线菌目节杆菌属的两株耐冷节杆菌Arthrobacter sp.Cjts和Arthrobacter strain A3,主要针对冷胁迫下节杆菌中OtsA的催化效率机制和表达调控机制进行研究。通过克隆otsA基因、表达并纯化融合蛋白、酶活分析、蛋白与蛋白相互作用等实验方法,得到以下结论:(1)节杆菌Arthrobacter sp. Cjts的OtsA在低温下的催化效率明显高于大肠杆菌的OtsA,造成这种高催化效率的原因是节杆菌OtsA在低温下对其底物UDP-葡萄糖具有较高的亲和性。(2)N-loop序列是OtsA催化中心的重要组成部分,节杆菌OtsA的N-loop序列置换入大肠杆菌OtsA中会提高其对UDP-葡萄糖的亲和性,反之则降低亲和性,说明OtsA的N-loop序列影响着OtsA对UDP-葡萄糖的亲和性,从而进一步影响催化效率。对N-loop序列的信息学分析表明N-loop的结构柔韧性可能是影响OtsA低温下的催化效率的原因之一(3)免疫印迹分析发现低温下节杆菌Arthrobacter strain A3体内的海藻糖水平变化主要受OtsA表达量的调控,与其他海藻糖代谢途径关系不大。通过野生型菌株与otsA过表达株、otsA敲除突变株低温下海藻糖变化的对比也可得到相同结论。(4)低温可以使节杆菌Arthrobacter strain A3体内OtsA水平下降,通过对otsA启动子区的分析得知其原因是OtsA的表达受到抑制。在最适生长温度下提高节杆菌体内海藻糖含量可以对otsA启动子区起到抑制作用,而冷休克初始也可以检测到节杆菌体内海藻糖水平有所上升,因此海藻糖在节杆菌体内的积累是抑制OtsA表达的一个因素。(5)免疫共沉淀及质谱分析发现EF-Tu因子可以直接与OtsA相互作用,且低温下这种相互作用得到增强。EF-Tu因子低温下可以稳定OtsA的表达,且这种稳定作用需要有OtsA的参与,因此推测低温下EF-Tu与OtsA的相互作用与使OtsA稳定表达有关。综上所述,本研究通过对节杆菌OtsA在低温下的催化效率和表达调控方面的研究,初步阐明了节杆菌OtsA低温下具有较高催化效率的机理,以及低温下调控OtsA表达的影响因素,在节杆菌及其他低温菌抗逆机制研究方面具有重要科学意义。
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