近年来频繁爆发的对虾病害引起了人们对对虾自身免疫机制的重视。目前普遍．认为虾类和其它无脊椎动物一样，体液中不具有免疫球蛋白，缺乏脊椎动物所具有的特异性免疫机制，主要依靠体内的非特异免疫因子来抵抗外来病原的入侵。溶菌酶是生物体内重要的非特异免疫因子之一，在引发和维持机体防御免疫的过程中起重要作用。本实验克隆了斑节对虾、短沟对虾和南美白对虾溶菌酶基因，并获得了基因工程斑节对虾溶菌酶，为进一步研究对虾溶菌酶机体内的转录、表达调控机制和免疫功能等奠定基础。因此，深入研究对虾免疫因子及其功能，为进一步了解对虾的免疫机制和直接应用提供理论依据。13种对虾溶菌酶基因的克隆与序列分析本实验参考多种生物类群的溶菌酶基因序列，设计并合成引物。分别提取斑节对虾、短沟对虾和南美白对虾血细胞总RNA。以此总RNA为模板，RT-PCR扩增获得特异性cDNA片段，纯化后克隆到T载体上。重组子序列测定表明，所克隆的3种对虾溶菌酶基因的开放阅读框(ORF)均为477bp，编码158个氨基酸，包括成熟肽140个氨基酸残基和信号肽18个氨基酸残基。同源性分析表明，所克隆的3种对虾溶菌酶基因的推测氨基酸序列之间有较高同源性，为87％以上；与人、鸡、鱼等多种生物类群的c-型溶菌酶氨基酸序列同源性也高于40％。3种对虾溶菌酶都具有c-型溶菌酶保守的两个酶活性位点谷氨酸残基(Glu<51>)和天门冬氨酸残基(Asp<68>)，以及保守的8个半胱氨酸残基(Cys)，因而推测所克隆的3种对虾溶菌酶基因属c-型溶菌酶基因。同时，由于所克隆的3种对虾溶菌酶在101、106、107位上缺少钙结合溶菌酶保守的天门冬氨酸残基(Asp)，可认为这两种对虾溶菌酶属于c-型溶菌酶的非钙结合亚型。2斑节对虾溶菌酶基因的表达2.1斑节对虾溶菌酶基因的原核表达采用PCR方法对斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造,与含温控启动子P<,R>P<,L>的表达质粒pBV220构建大肠杆菌表达质粒pBV220-lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS-PAGE电泳表明,表达产物中有16kD左右的特异性条带,与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示,重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32[％],纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90[％]左右。2.2斑节对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达改造斑节对虾溶菌酶基因cDNA,构建斑节对虾溶菌酶的酵母分泌表达质粒pPICZαA-lyz。该质粒线性化后转染毕赤酵母Gs115,经Zeocin抗性筛选获得斑节对虾溶菌酶的酵母表达工程菌。该菌在BMGY培养基中甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测培养基上清。结果表明,表达产物中有约16kD的特异性条带,与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。3重组斑节对虾溶菌酶的溶菌活性检测在大肠杆菌中表达的重组斑节对虾溶菌酶以包涵体形式存在,没有生物活性。复性后重组斑节对虾溶菌酶具有溶菌活性,其溶菌活力为60U/mg,最适pH为6.0,最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶的抗菌谱,结果表明重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌、溶藻弧菌和鳗弧菌有较强的溶菌活力,对爱德华氏菌有一定的溶菌活力,而对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和大肠杆菌DH5α溶菌活力较弱。