抑制植物病原真菌的北极海洋细菌活性菌株及代谢产物研究

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极地海洋沉积物成分复杂、营养丰富,蕴藏了大量的微生物,极地的特殊生境造就了微生物的多样性与新颖性。利用极地微生物筛选抑制植物病原真菌的活性菌株和活性代谢产物,对于丰富菌种资源库和研发极地微生物源农药具有重要的研究意义。本论文将北极海域海洋沉积物样品与细菌筛选培养基混合培养,从北极海底沉积物中共分离到69株细菌,并对它们进行分子鉴定与系统发育分析。系统发育分析结果表明:鉴定的69株细菌分别属于Pseudoalteromonas、Shewanella、Psychromonas、Pseudomonas、Marinomonas、Halomonas、Psychrobacter、Loktanella、Microbacterium、Arthrobacter、Planomicrobium、Planococcus、Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Flavobacterium、Maribacter、Olleya18个属。以希瓦氏菌属(Shewanella),嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromona)居多,为本次研究北极海洋沉积物可培养细菌中的优势菌群,进而扩大了人们对北极细菌的认知领域。同时采用平板扩散法,以番茄灰叶斑和辣椒疫霉为指示菌,对这69株细菌进行抑菌活性菌株的筛选,从中获得了4株对番茄灰叶斑和辣椒疫霉有抑菌活性的细菌,其编号分别为:R06-1、2018、R11和C13-2,并对它们进行系统发育分析和抑菌谱的测定。系统发育分析结果表明:筛选到的4株活性菌株均为细菌域(Bacteria)变形杆菌门(Proteobacteria)的γ-变形杆菌(γ-Proteobacteria)。其中菌株R06-1属于希瓦氏菌属(Shewanella)、2018和C13-2属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、R11-1属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)。抑菌谱测定结果表明:所筛选到的4株活性菌株对番茄灰叶斑和辣椒疫霉的抑菌圈直径均在20.00mm以上。菌株R06-1和2018对指示菌的抑菌圈直径均达25.00mm以上,抑菌效果最好,达到强抑制作用,将会作为目标菌株进一步研究其活性物质的成分。对其中一株抑菌活性较强的北极细菌Shewanella sp.R06-1进行发酵,通过抑菌活性追踪检测,采用乙酸乙酯萃取、减压硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、RP-18反相硅胶柱色谱及HPLC制备等方式,对菌株Shewanella sp.R06-1发酵上清液中的抑菌成分进行分离纯化,得到1个纯化合物(R06-01-3-1),活性验证结果表明:化合物R06-01-3-1对辣椒疫霉有微弱的抑菌效果;同时采用质谱(MS)、氢谱(1H NMR)/碳谱(13C NMR)以及二维谱等技术对化合物的结构进行鉴定。结果表明:化合物R06-01-3-1的结构为Cyclo(D-Pro-L-Tyr)。该化合物首次在细菌Shewanella sp.中分离得到,对辣椒疫霉的活性为首次报道。对另一株具有较强抑菌活性的北极细菌Pseudoalteromonas sp.2018用50L发酵罐进行大规模发酵,通过抑菌活性追踪检测,采用乙酸乙酯萃取、反相ODS硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、MPLC及HPLC制备等分离方式从乙酸乙酯提取物中得到5个化合物(1~5),鉴定这5个化合物结构分别为:Cyclo(D-Pro-L-Tyr)(1),Cyclo(R-Pro-R-Phe)(2),Cyclo(L-Ile-L-Pro)(3),Cyclo(L-Pro-L-Leu)(4)和苯乙酸(5)。本研究是对北极细菌Pseudoalteromonas sp.抑制番茄灰叶斑和辣椒疫霉活性研究的首次报道,以上5个化合物均为首次从北极细菌Pseudoalteromonas sp.中分离得到。
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