天然免疫(Innate immunity)是一种古老的宿主防御系统,广泛分布在不同生物体中并处于抵御病原体感染的第一线。Toll样受体(Toll-like receptor,简称TLR)是脊椎动物天然免疫系统中关键的模式识别受体,其可特异性的识别并结合病原体中保守的病原相关分子模式(PAMP)进而引发一个天然免疫反应,并使适应性免疫系统做好准备。与传统认识不同,Toll样受体的发现使人们认识到天然免疫系统识别病原体事实上是专一性的。脊椎动物Toll样受体多基因家族已被发现可特异识别多种结构迥异的配体,如脂质、脂蛋白、聚糖、蛋白质、核酸等等。然而,对于脊椎动物Toll样受体如何发展出这种配体识别的多样性目前还不清楚。Toll样受体是表达在细胞表面或胞内小室的I型跨膜糖蛋白,通常由识别配体的N-末端胞外结构域、单次跨膜螺旋和转导信号的C-末端胞内TIR(Toll/IL-1 receptor)结构域构成。本文利用脊椎动物Toll样受体胞外域少数已知的结晶结构和大量通过穿线法获得的模建结构,开展了对Toll样受体多基因家族识别多样配体机制的研究。结合结构分析、系统发生分析、比较基因组分析、进化分析等,本文提出了Toll样受体胞外域架构(Architecture)影响其配体识别特异性,并据此进一步对几种配体尚不清楚的脊椎动物Toll样受体进行了分析和预测。本文的研究内容和主要结果如下：1.胞外域架构影响Toll样受体识别病原体的特异性Toll样受体多基因家族的数千成员被在脊椎动物基因组中识别了。Toll样受体负责识别配体的胞外域呈马蹄铁样形状,由数个富含亮氨酸重复区域(LRR)构成。胞外域中相邻LRR模块凹面保守的天冬酰胺位点间可以形成有助于稳定其整体结构的氢键网络(被称为天冬酰胺梯子)。我们对脊椎动物28种Toll样受体的结构分析显示,胞外域存在三种架构：具有完整天冬酰胺梯子的单域型架构、梯子中部被破坏的三域型架构和梯子两端被破坏的反三域型架构。进一步的,我们判定了目前已知的1428个完整脊椎动物Toll样受体的TLR类型,并基于序列和结构上的差异将它们划分为8个家族。来自同一家族Toll样受体的胞外域具有相同架构,并识别相似配体。系统发生分析显示,Toll样受体胞外域的三种架构在脊椎动物进化早期就已出现。胞外域架构影响了Toll样受体识别和结合配体的特异性,具有三域型架构的Toll样受体结合疏水配体,而具有单域型或反三域型架构的Toll样受体则主要结合亲水配体。除少数例外,具有三域型架构的Toll样受体主要应答细菌类和真菌类病原体,多数具有单域型架构的Toll样受体识别病毒,而具有反三域型架构的Toll样受体则主要结合原生动物寄生虫成分。具有三域型架构的Toll样受体主要表达在细胞表面,而单域型和反三域型则大多表达在细胞内的膜泡。三域型架构和反三域型架构都报道有以异源二聚体形式工作的Toll样受体,而已知的具有单域型架构的Toll样受体则都是同源二聚体。此外,Toll样受体胞外域架构的差异可能还深刻地影响了脊椎动物的进化。我们对39种脊椎动物基因组的比较分析显示,陆生脊椎动物基因组中具有单域型架构的Toll样受体基因的数目只有水生脊椎动物基因组的一半。dN/dS值表明纯净选择是驱动脊椎动物Toll样受体进化的主要驱动力。在哺乳动物中,具有单域型架构的Toll样受体基因比具有三域型架构的Toll样受体基因受到了更强的纯净选择作用。2.反三域型TLR19识别病原体预测尽管从TLR19首次被鉴定至今已超过十年,但目前对TLR19的了解还很少,尤其是TLR19识别的配体仍不清楚。系统发生分析表明,TLR19属于家族11,其与TLR20以及TLR11/12在进化树上聚成一簇。TLR20是TLR19最近源的旁系同源物。TLR19胞外域含有24个LRR模块。胞外域结构分析显示,TLR19及其所属的家族11都具有反三域型架构,其胞外域中天冬酰胺梯子的两端被破坏了。表面静电势分析表明,TLR19胞外域三维结构中上升侧表面比下降侧表面具有更强的极性。具有较强表面静电势的上升侧表面可能主要参与了TLR19胞外域与配体的结合。TLR19胞外域的反三域型架构和表面静电势分布都与TLR11和TLR12相似,因此TLR19也很有可能与TLR11/12一样识别来自原生动物的蛋白质类配体。此外,TLR19基因座上的dN/dS值很小,表明TLR19进化受到了强的功能约束。TLR19编码序列中大约三分之一的密码子经受了显著的负选择作用,而只有5个密码子被发现经受了显著的正选择作用。3.三域型TLR27的鉴定及其识别病原体预测通过构建所有已知脊椎动物Toll样受体序列的系统发生关系,一种新型的Toll样受体被识别并命名为TLR27。TLR27目前仅在全骨鱼类的鳝鱼、肉鳍鱼类的腔棘鱼和软骨鱼类的鲨鱼中被发现了。TLR27属于家族1,在进化树上与TLR14/18和TLR25聚成一簇。模块预测显示TLR27的胞外域含有19个LRR模块。对胞外域模建结构的分析表明,TLR27具有三域型架构。中央亚结构域凹面保守天冬酰胺的缺失导致TLR27胞外域产生了结构扭转,进而在中央亚结构域和C-末端亚结构域的交界处形成了一个明显的疏水口袋,这个疏水口袋正好位于LRR11和LRR12模块之间。与家族1中其他功能已知的Toll样受体类似,我们推测TLR27可以利用胞外域结构中的这个疏水口袋结合疏水配体,进而识别并应答病原体。进化分析表明,TLR27基因座上的dN/dS值非常低,TLR27序列中大约四分之一的密码子被发现经受了显著的负选择作用,而只有2个受正选择作用的密码子被识别了。4.单域型TLR15独特病原体激活机制分析TLR15被报道具有一种独特的激活机制。TLR15可因胞外域被细菌和真菌分泌的毒力相关的蛋白酶裂解而导致激活。目前对具有独特激活机制的TLR15的结构和进化特征了解的还很少。利用最近被大量测序的脊椎动物基因组,我们鉴定出了57个完整的TLR15基因,其中54个来自鸟类,3个来自爬行动物。系统发生分析显示,这些TLR15聚成一个单独的进化枝并邻近家族1。然而与家族1Toll样受体胞外域所具有的天冬酰胺梯子中部被破坏的三域型架构不同,全部57个TLR15的胞外域都具有完整的天冬酰胺梯子,属于单域型架构。因此,我们建议将TLR15单列为一个单独的家族,即家族15。进一步的,氨基酸进化保守性分析发现TLR15胞外域在LRR11模块凸表面具有一个高度进化保守的区域,这个区域可能包含了TLR15激活过程中胞外域被蛋白酶裂解的关键靶点。此外,蛋白质-蛋白质对接分析表明TLR15的胞内TIR结构域可以形成同源二聚体,预测的TIR二聚体相互作用表面主要由来自BB环和aC螺旋的残基组成。尽管TLR15主要经受纯净选择作用,但我们仍然在TLR15中检测到了27个显著受正选择作用的位点,并且发现其中24个位于胞外域中。总之,以上这些发现将有助于理解脊椎动物天然免疫系统为何能够通过Toll样受体识别多样的病原体,也可以为预测那些功能未知的Toll样受体的潜在配体提供线索。同时,增进对Toll样受体与病原体配体相互作用的了解,也有助于对人类Toll样受体基因变异所引发疾病的防治。