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本研究于2012年4月和7月先后从山东和陕西分别采集了54份和50份苹果叶片样品。从文献中筛选了苹果花叶病毒(Apple mosaic virus, ApMV),苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid, ASSVd),苹果绿皱果病毒(Apple green crinkle virus, AGrCV),苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV),苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)等5种苹果病毒类病原物的特异性引物,对山东和陕西部分随机挑选的样品进行检测,结果显示,除ApMV检测呈阴性外,从部分样品中均检测到其余4种病原的特异性条带,将扩增得到的基因片段进行克隆测序和序列分析,明确了样品受到ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的侵染。根据RT-PCR检测结果和测得的基因序列,结合GenBank中已报道的相关病毒的基因序列,设计扩增这4种病毒类病原物的特异性引物,经过筛选,并经扩增体系和扩增条件的优化,最终建立了同时扩增ASSVd、ASPV、ACLSV和ASGV的多重RT-PCR体系。对该检测体系进行了特异性和灵敏性测试,结果表明,多重RT-PCR扩增的特异性强,能同时检测出4种病毒类病原物的最低检出限为10-2ng级。利用该多重RT-PCR选取了100份采自山东和陕西苹果叶片样品进行了检测,检测情况表明,在青岛、烟台、渭南和咸阳4个地区的样品中均检测出4种病毒类病原,其中山东地区优势病毒种为ASPV,青岛和烟台的检出率分别为88.9%和84.4%,而陕西地区的优势种为ASGV和ASPV,渭南和咸阳ASGV检出率分别是81.0%和79.3%,ASPV检测率也分别是81.0%和79.3%。ACLSV在4个地区样品中的检测率相对较低。4个地区所采集的样品中病毒复合侵染现象严重,其中青岛、烟台、渭南和咸阳样品中复合侵染率分别为66.7%,75.0%,85.7%和89.7%。青岛、烟台、渭南和咸阳的最主要的复合侵染类型分别为ACLSV+ASPV+ASSVd、ASGV+ASPV、ASGV+ASPV+ASSVd和ASGV+ASPV+ASSVd.为研究ACLSV病毒的变异情况,将ACLSV全长序列分为6段进行扩增,分别得到了2435bp、1435bp、861bp、1605bp、1095bp和749bp的基因片段,经过测序分析,确认基因序列正确,经DNAStar SeqMan进行拼接得到ACLSV基因组7557bp全长序列(登录号KJ522693)。该全基因组包含3个开放阅读框,分别编码RNA聚合酶、运动蛋白和外壳蛋白,5’UTR和3UTR分别有151nt和195nt的非编码区。经全基因组构建进化树分析,该ACLSV全序列与日本的苹果分离物B6序列(GenBank no. AB326224)核苷酸相似性最高,为85.9%。本文研究了ASGV外壳蛋白基因(CP)的原核表达。将ASGV CP的克隆重组载体和表达载体pET-28a(+)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ于37℃酶切反应过夜,纯化回收酶切产物,用T4DNA连接酶4℃连接反应过夜,转化到大肠杆菌DH5a感受态中繁殖,经菌液酶切和PCR鉴定,挑选阳性克隆的菌液测序验证,测序结果表明,目的片段ASGV CP正确克隆到表达载体pET-28a(+)中,说明原核表达载体构建成功。提取己构建成功的原核表达载体pET-28a-ASGV-CP质粒,转化到表达菌株BL21(DE3) pLysS感受态细胞中,37℃培养至菌液OD值0.6-0.8,加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L,继续于27℃培养3.5小时,将菌液离心、悬浮,加入2×上样缓冲液,煮沸10min,冷却后进行SDS-PAGE电泳分析,电泳显示有33kDa目标蛋白表达,结果表明融合蛋白在BL21(DE3)pLysS中已成功表达。用标签蛋白纯化回收试剂盒获得纯化的融合蛋白,为下一步的抗血清制备奠定了基础。