[目的]在前期研究中通过基因重组及噬菌体肽库方法获得agrC特异性结合的多肽序列基础上,研究表皮葡萄球菌agrC特异结合多肽对表皮葡萄球菌在生物材料表面生物膜形成的作用机制,为合成以agrC为靶点治疗表皮葡萄球菌生物膜形成相关感染的特异性多肽药物奠定基础。[方法]1.按照不同的agrC特异结合多肽(N1)和无关肽(NO)终浓度(Oμg/ml、1OOμg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml)分为实验组和对照组,实验组N1多肽6个浓度梯度组,对照组NO多肽6个浓度梯度组;以聚氯乙烯(Polyvinyl Chloride,PVC)材料的96孔板作为细菌生物膜附着载体,选用表皮葡萄球菌标准菌株(ATCC35984生物膜表型阳性菌株、ATCC12228生物膜表型阴性菌株)作为实验菌株培养24h;采用结晶紫染色半定量检测法评估生物膜形成能力,确定N1多肽最佳抑菌浓度。2.根据加入多肽不同将agrC特异结合多肽(N1)作为实验组,无关肽(NO)作为对照组,灭菌水的作为空白对照组(N1组、NO组多肽终浓度为前期已确定的最佳抑菌浓度,空白组加入等量灭菌水),选用表皮葡萄球菌标准菌株(ATCC35984生物膜表型阳性菌株)作为实验菌株,各组对应加入N1多肽、NO多肽及灭菌水后培养6h、12h、18h、24h、30h后,①采用二甲氧唑黄(XTT)比色法检测表皮葡萄球菌生长动力;②采用Quantitative Real-time PCR法检测表皮葡萄球菌生物膜相关基因(atlE、icaA、fbe、icaR)表达的变化;③采用硫酸-苯酚法,使用分析纯葡萄糖标准品制作标准曲线,再测定表皮葡萄球菌490nm处光密度(Optical Density,OD)值计算与表皮葡萄球菌生物膜形成密切相关的PIA含量;④采用PRM相对定量蛋白组学测定与表皮葡萄球菌毒力因子、生物膜播散相关的短肽PSMs含量。[结果]1.随着agrC特异结合多肽终浓度增加对生物形成能力抑制作用加强,当agrC特异结合多肽终浓度为800μg/ml时,生物膜形成能力最弱(OD均值为0.901),组内、组间比较差异有统计学意义(P<0.05);当agrC特异结合多肽终浓度继续增高达到1600μg/ml时对细菌生物膜形成能力不再继续减弱(OD均值为1.127)。表明N1多肽800μg/ml为最佳有效抑菌浓度,并且随着浓度继续增加抑菌作用不再加强。2.XTT比色法检测发现在6h,N1组细菌生物膜生长动力(OD均值0.317)明显高于N0组(OD均值0.167)和灭菌水组(OD均值0.204),差异有统计学意义(P<0.05);在12h,N1组细菌生物膜生长动力(OD均值0.124)明显低于N0组(OD均值0.288)和灭菌水组(OD均值0.264),差异有统计学意义(P<0.05);培养18h、24h、30h的N1组、NO组和灭菌水组生物膜生长动力差异无统计学意义(P>0.05)。表明N1多肽抑制生物膜形成主要作用在生物膜形成聚集期。3.Quantitative Real-time PCR 法检测发现培养 12h 的 N1 组 atlE、icaA、fbe、icaR基因表达与NO组和灭菌水组比较均为下调,差异有统计学意义(P<0.05);培养6h、18h、24h、30h的N1组atlE、icaA、fbe、icaR基因表达与N0组和灭菌水组比较均为上调,差异有统计学意义(P<0.05)。表明N1多肽在生物膜聚集期可下调生物膜成膜基因atlE、icaA、fbe,而其他时期可上调生物膜抑膜基因icaR。4.硫酸-苯酚法测定发现细菌生物膜PIA含量随着时间增长而增加,培养6h的N1组、NO组和灭菌水组PIA含量相同,无统计学差异(P>0.05);培养12h的N1组PIA含量(PIA含量均数0.00190mg)低于NO组(PIA含量均数0.00543mg)和灭菌水组(PIA含量均数0.00563mg),差异有统计学意义(P<0.05);培养18h、24h、30h的N1组、NO组和灭菌水组PIA含量相同,无统计学差异(P>0.05)。表明N1多肽在生物膜聚集期可抑制PIA合成。5.PRM相对定量蛋白组学测定PSMs含量比较:培养6h的N1组含量高于NO组和灭菌水组;培养12h的N1组含量高于NO组和灭菌水组;培养18h的N1组含量高于NO组和灭菌水组;培养24h的N1组高于NO组,低于灭菌水组;培养30h的N1组均低于NO组和灭菌水组。表明N1多肽在生物膜成熟期及播散期可抑制PSMs的合成。[结论]1.表皮葡萄球菌agrC特异结合多肽在抑制表皮葡萄球菌生物膜形成时存在浓度-效应关系,当达到一定的浓度(800μg/ml)时,对表皮葡萄球菌生物膜形成抑制作用最为显著。2.表皮葡萄球菌agrC特异结合多肽在表皮葡萄球菌生物膜形成的聚集期通过抑制表皮葡萄球菌agr群体感应系统活化,下调成膜基因atlE、icaA、fbe的表达,也在生物膜成熟期和播散期抑制PSMs合成,这可能是其抑制生物材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的主要作用机制。