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目的利用荧光实时定量PCR检测水环境中贝类组织中的人类肠道病毒含量,初步探索该病毒量与水体中病毒含量的关系。方法利用PEG(聚乙二醇)沉淀法沉降贝类组织中的人类肠道病毒,沉淀物接种至Vero细胞中观察是否出现CPE反应。沉淀病毒之前的洗脱法分为甘氨酸洗脱法(传统的)和甘氨酸-苏氨酸洗脱法(新提出的),空斑法检测两种洗脱-沉淀方法的回收率。同期所采的水样(滤膜法)经牛肉膏洗脱再经PEG沉淀。贝类样品及水样均用TRIzol法和试剂盒法提取肠道病毒RNA,根据OD260/280值以及吸光度全面扫描的测定结果分析两种提取方法所提RNA的质量差别。PCR反应中使用人类肠道病毒通用引物,提取RNA后进行普通RT-PCR反应。在对贝类样品及水样进行绝对定量之前,需制备用来制作标准曲线的荧光定量质粒标准品。本实验中质粒菌为实验室利用T-A克隆法自行制备(含有肠道病毒PCR产物目的片段)。通过菌液PCR和质粒PCR反应对质粒菌进行筛选并提取出纯度符合要求的质粒,检测DNA浓度换算出拷贝数进行荧光定量PCR反应。根据熔解曲线判断四组引物浓度(a组:300 nM /300 nM ,b组:200 nM /200 nM,c组:100 nM /100 nM,d组:50 nM /50 nM)的引物二聚体的形成情况,选择合适的引物浓度。对标准品进行10倍系列稀释,通过观察扩增曲线等选择合适的质粒标准品的稀释度范围制备标准曲线。进行荧光定量PCR反应,检测贝类组织样品及水样中的肠道病毒含量。结果贝类组织的沉淀物接种至Vero细胞,出现明显的CPE反应。两种洗脱方法,甘氨酸洗脱法(全贝)的回收率为19.6%,甘氨酸-苏氨酸洗脱法(贝类肠道)的回收率为13.1%,选择甘氨酸洗脱法进行后续实验。TRIzol法和试剂盒法提取RNA的OD值260/280比较结果差异有统计学意义(t值=8.53,P值<0.05),全面扫描显示TRIzol法中残留的小分子盐类物质(OD=230 nm)较多,而试剂盒法的波峰集中于核酸吸收峰处(OD=260 nm),试剂盒法提取RNA纯度较好。贝类组织及水样经过普通PCR反应,凝胶电泳均显示明显的目的条带片段,用PEG法提取肠道病毒较成功。菌液PCR和质粒PCR反应均显示明显的目的条带,OD值260/280均大于1.8,提取的质粒DNA较纯。优化后的引物浓度为100 nM /100 nM,选择稀释度范围为103~107的质粒标准品制作标准曲线进行实时定量PCR反应,贝类样品中检测出的肠道病毒拷贝量最高为1.12×103同期所采的水样中检测出的病毒拷贝量为2.35×102,换算为原始水样体积(原始体积136L)则贝类样品相当于浓缩了水环境中肠道病毒达3.1×104倍。结论利用PEG沉淀法沉降贝类组织中的人类肠道病毒效果较好,回收率符合检测要求。质粒标准品纯度高稳定性较好,适用于实时定量PCR反应,绝对定量结果显示贝类可以浓缩水环境中的肠道病毒,能够反应水体病毒情况。