牛奶氨基糖苷类抗生素残留的适配体传感器制备方法研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:WSZHOUSHUWU
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抗生素在奶牛养殖业中的广泛应用,使牛奶等动物源食品中可能存在多种抗生素残留。目前抗生素的主要检测方法是灵敏度高的仪器分析法,但是由于成本较高和前处理较繁琐,已经不能满足日益增多的大量样本快速、及时、高效检测的要求。迫切需要开发研究一种检测技术用于多种抗生素残留的同时检测。基于适配体的传感分析方法得到广泛关注。在识别上,适配体具有抗体无可比拟的优势,利用特殊元素标记技术可解决多种抗生素同时检测的问题。适配体是通过体外选择技术筛选的短的RNA或单链DNA序列,其特异性识别并结合其预选的靶标,包括小分子,离子,蛋白质甚至全细胞。目前已经筛选和使用了多种对抗生素具有高度特异性的适配体。构建适配体传感器利用高特异性、高亲和力的适配体与靶标物质结合前后电信号转变实现目标物分析。本文主要构建基于RNA和DNA适配体的传感器检测单一、多种抗生素。具体研究内容如下:(1)单一抗生素的RNA适配体传感器研究以新霉素(NEO)为模型,构建了一个基于二茂铁-多壁碳纳米管(Fc-MWCNTs)和介孔纳米四氧化三铁@二氧化硅(Fe3O4@SiO2)的单一抗生素适配体传感器。该适配体传感器的高灵敏度归因于Fe3O4@SiO2和Fc-MWCNTs的较高导电性,MWCNTs用作电子传递介质,由于其良好的电子传递能力,在Fc的存在下大大改善了电信号。为进一步固定适配体,促进电子转移,采用水热和化学活化法成功制备出比表面积大的Fe3O4@SiO2微球。识别NEO不同部位的两种RNA适配体和NEO形成“三明治”夹心结构。该适配体传感器具有对NEO的较低检出限(LOD,759 pM)和良好性能。此外,该适配体传感器可较好地用于牛奶中NEO的检测,其加标回收率在91.47%-106.35%之间。(2)多种抗生素的RNA适配体传感器研究以卡那霉素(KAN)和妥布霉素(TOB)为模型,构建了一个基于纳米金壳(AuNSs)的高度灵敏的RNA适配体传感器检测两种抗生素。壳体结构的AuNSs可以更好地结合适配体且具有良好的导电性。硫化镉纳米复合物(CdS)被亲和素(SA)修饰后可与生物素标记的KAN适配体(Bio-KAP)特异性结合。以同样的方式,修饰硫化铅纳米复合物(PbS)的SA和Bio标记的TOB适配体(Bio-TAP)结合。KAP-Bio-SA-CdS和TOP-Bio-SA-PbS修饰到AuNSs/GE(金电极)上构建检测KAN和TOB的适配体传感器,该适配体传感器对KAN和TOB的LOD分别为0.125 nM和0.489 nM,且能较好地检测于实际牛奶样品的KAN和TOB。(3)单一抗生素的DNA适配体传感器研究以KAN为模型,构建了一个基于双链DNA(dsDNA)修饰金纳米粒子(AuNPs)/硫化镉纳米粒子(CdS)/金电极(GE)的适配体传感器。CdS纳米粒子通过表面的相互作用吸附在GE表面,AuNPs为导电中介提高整个电子传递过程中的电子传递和传感器的响应速度。使用dsDNA比单链DNA(ssDNA)构建的适配体传感器LOD低得多(dsDNA,2.85 nM;ssDNA,9.76 nM)。该KAN适配体传感器具有良好的性能,即使在复杂混合物如脱脂牛奶中,该传感器可以高选择性地确定检测目标KAN。以KAN为模型,构建了一个基于有序介孔碳-壳聚糖(OMC-CS)和链霉亲和素标记金纳米粒子(AuNPs-SA)以及二茂铁标记DNA(Fc-DNA2)的双重信号放大策略的适配体传感器。DNA1链被生物素(Bio)标记,通过Bio-SA高亲和力系统结合与AuNPs-SA表面,当KAN存在时,Fc-DNA2靠近电极增加了电极表面的电流信号。该适配体传感器的LOD较低(47.2 pM),且性能良好,此外,也显示出良好的特异性,不受竞争性类似物的干扰,该传感器可以用来检测在实际牛奶样品中的KAN,这对其他抗生素的检测也有很大的潜力。(4)多种抗生素的DNA适配体传感器研究以KAN和链霉素(STR)为模型,构建了一个基于金属离子作为信号示踪物和纳米复合材料作为信号放大策略的多种抗生素适配体传感器同时检测两种抗生素。该适配体传感器具有较高的电化学传导性,这是由于AuNPs和纳米棒状的OMC具有较高电子传递能力和比表面积等一些特点。此外,CNFs和OMC-AuNPs可以均匀牢固地黏附在丝网印刷电极(SPCE)表面,适配体的互补链也可以很好地固定在OMC-AuNPs/CNFs/SPCE上。在差分伏安(DPV)的不同电压下金属离子如Cd2+和Pb2+能分别产生电流峰。在没有KAN和STR存在的情况下,适配体与其互补链互补配对。在KAN和STR存在的情况下,适配体与目标物绑定,导致金属离子标记的适配体与目标物结合从互补链上离开,从而得到CdS和PbS的变化电流峰值。该传感器对KAN和STR的LOD分别为87.3 pM和45.0 pM,可较好的检测加标牛奶样品中的KAN和STR。以KAN和STR为模型,构建了一个基于金属离子作为信号示踪物和纳米复合材料作为信号放大策略的多种抗生素适配体传感器同时检测两种抗生素。KAN的适配体(KAP)的互补链(cKAP)和STR的适配体(STP)的互补链(cSTP)用PolyA结构连接(cSTP-PolyA-cKAP)以增加其构象的自由度。作为传感平台的碳纤维-纳米金(CNFs-AuNPs)和石墨化多壁碳纳米管(MWCNTGr)具有较大的表面面积可以捕获更多的cSTP-PolyA-cKAP,该传感器对KAN和STR的LOD分别为74.50 pM和36.45 pM,可以通过替换适配体和使用更多具有分离信号的纳米金属离子标记相应适配体,达到同时检测牛奶中更多抗生素的目的。
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