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目的：
蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一种出血性脑卒中，具有极高的死亡率和致残率。大量研究证实，早期脑损伤(Early brain injury，EBI)是SAH后高致死、致残率的主要原因。神经血管单元(Neurovascular unit，NVU)概念的提出更好地解释了EBI发生的结构基础及病理生理过程。在前期脑缺血研究中我们发现β石竹烯(β-caryophyllene，BCP)具有改善脑循环减轻神经功能受损的作用，但因其理化性质影响了其在体内研究的应用。本研究首先制备了改善β石竹烯理化性质的制剂--β石竹烯脂质体(β-caryophylleneloadedliposomes，BCP-LP)，然后通过构建大鼠SAH模型，使用BCP-LP干预以评估其对EBI的保护作用，进一步探讨对NVU损伤的改善作用，并初步探讨其作用的生物学机制。
方法：
1、采用乙醇注入-超声分散法制备BCP-LP，然后考察其包封率、显微形态、微粒粒径、ζ电位和体外释放行为，建立BCP体内测定方法，并初步检测其体内生物利用度。
2、选用雄性SpragueDawley大鼠，通过视交叉前池注血法构建SAH模型，随机分为Sham组(空白对照组)、SAH组(模型对照组)、SAH+solvent组(溶剂对照组)、SAH+BCP-LP组(药物实验组)。采用神经行为学评分以及平衡木实验评分，分别检测各组大鼠建模后在6h、12h、24h、48h和72h的行动能力和平衡能力；同时在上述时间点监测各组大鼠皮层脑血流(Cerebral blood flow，CBF)评估脑供血情况。通过检测伊文思蓝(Evans blue，EB)在大脑组织中的渗出率评估各组大鼠在SAH后72h的血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)通透性以反映BBB破坏程度，脑组织干湿重法检测各组大鼠脑水肿的程度。通过上述实验评估各组大鼠EBI水平。
3、在建模后72h，通过蛋白免疫印迹实验(Western blot test，WB)检测紧密连接蛋白Occludin和Zonulaoccludens-1(ZO-1)的表达程度以反映紧密连接损伤情况，TUNEL染色和WB检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3的表达以反映各组大鼠脑组织的细胞凋亡程度。通过WB实验评估各组大鼠血管内皮细胞表面受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fabrilary acidic protein，GFAP)和层粘连蛋白-α(Laminin-α，LN-α)的表达以代表各种NVU结构蛋白的表达程度，并通过免疫组织化学染色和荧光染色观察VEGFR-2和GFAP在脑组织的分布形态和表达情况。进一步通过免疫组化和WB实验验证各组大鼠脑组织大麻素Ⅱ型受体(Cannabinoid receptor type 2，CB2)的分布和表达情况，检测脑组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptor-γ，PPARγ)和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表达情况，以阐明BCP-LP在EBI中的作用机制。
结果：
1、采用乙醇注入-超声分散法成功制备了BCP-LP，其包封率约为81%。透射电镜观察BCP-LP球形颗粒，激光粒度仪测得其平均粒径为189.3±3.8nm，平均ζ电位为-13.9±0.3mV。体外释放行为考察发现BCP可从脂质体中释放出来，并且与物理混合物相比有一定缓释作用。体内实验发现与BCP-OLOIVE相比，BCP-LP可提高BCP在血浆中的药物浓度。
2、各组SAH模型大鼠均表现出严重的神经功能缺陷，在建模后24h以后，BCP-LP干预组大鼠逐渐表现出更好的神经修复能力，在术后72h，BCP-LP的干预使SAH大鼠的行为能力和平衡力几乎恢复至正常水平，与SAH组相比表现出更好更快的功能恢复。在大鼠SAH术后可见CBF明显受损，直至术后48h以后，BCP-LP组大鼠与SAH组大鼠相比明显地改善了SAH大鼠的CBF。SAH后72h检测到大鼠显著的BBB破坏和脑水肿，而在BCP-LP干预组大鼠表现出更少的EB渗出率，提示BCP-LP可促进BBB的修复减轻脑水肿。
3、紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的表达在SAH后72h明显减少，BCP-LP治疗组大鼠脑组织紧密连接蛋白的表达明显高于SAH组大鼠；采用TUNEL染色检测证实SAH大鼠海马神经细胞的凋亡发生明显，WB检测发现凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase3的表达有所增加，BCP-LP的治疗促进了Bcl-2的表达，抑制了Bax的表达和Caspase3的活化。
4、在SAH术后可见GFAP和VEGFR-2的表达明显增加，胶质细胞和皮层微血管的过度增生，而层粘连蛋白的丢失增加。BCP-LP的干预抑制了GFAP和VEGFR-2的过度表达，同时促进了LN-α的表达增加。CB2在大鼠脑组织中主要在细胞膜和胞浆中表达，SAH后CB2的表达代偿性增加，BCP-LP的干预能够显著增加CB2的表达水平。与此同时，大鼠SAH后PPARγ和MMP-9的表达均增加，而随着BCP-LP的干预上调CB2表达后，PPARγ的表达随之上调，并明显降低MMP-9的表达量。
结论：
1、实验成功制备BCP-LP，并且BCP-LP的体内应用可提高BCP的生物利用度；
2、BCP-LP可通过修复BBB破坏维持其完整性，减轻脑水肿，进而改善CBF，减轻SAH后的神经功能障碍，从而改善EBI发挥神经保护作用；
3、BCP-LP减轻EBI的作用可能是通过调控CB2/PPARγ/MMP-9分子通路，减少细胞凋亡，保护紧密连接蛋白，修复NVU损伤实现的。
蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一种出血性脑卒中，具有极高的死亡率和致残率。大量研究证实，早期脑损伤(Early brain injury，EBI)是SAH后高致死、致残率的主要原因。神经血管单元(Neurovascular unit，NVU)概念的提出更好地解释了EBI发生的结构基础及病理生理过程。在前期脑缺血研究中我们发现β石竹烯(β-caryophyllene，BCP)具有改善脑循环减轻神经功能受损的作用，但因其理化性质影响了其在体内研究的应用。本研究首先制备了改善β石竹烯理化性质的制剂--β石竹烯脂质体(β-caryophylleneloadedliposomes，BCP-LP)，然后通过构建大鼠SAH模型，使用BCP-LP干预以评估其对EBI的保护作用，进一步探讨对NVU损伤的改善作用，并初步探讨其作用的生物学机制。
方法：
1、采用乙醇注入-超声分散法制备BCP-LP，然后考察其包封率、显微形态、微粒粒径、ζ电位和体外释放行为，建立BCP体内测定方法，并初步检测其体内生物利用度。
2、选用雄性SpragueDawley大鼠，通过视交叉前池注血法构建SAH模型，随机分为Sham组(空白对照组)、SAH组(模型对照组)、SAH+solvent组(溶剂对照组)、SAH+BCP-LP组(药物实验组)。采用神经行为学评分以及平衡木实验评分，分别检测各组大鼠建模后在6h、12h、24h、48h和72h的行动能力和平衡能力；同时在上述时间点监测各组大鼠皮层脑血流(Cerebral blood flow，CBF)评估脑供血情况。通过检测伊文思蓝(Evans blue，EB)在大脑组织中的渗出率评估各组大鼠在SAH后72h的血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)通透性以反映BBB破坏程度，脑组织干湿重法检测各组大鼠脑水肿的程度。通过上述实验评估各组大鼠EBI水平。
3、在建模后72h，通过蛋白免疫印迹实验(Western blot test，WB)检测紧密连接蛋白Occludin和Zonulaoccludens-1(ZO-1)的表达程度以反映紧密连接损伤情况，TUNEL染色和WB检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3的表达以反映各组大鼠脑组织的细胞凋亡程度。通过WB实验评估各组大鼠血管内皮细胞表面受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)、胶质纤维酸性蛋白(Glial fabrilary acidic protein，GFAP)和层粘连蛋白-α(Laminin-α，LN-α)的表达以代表各种NVU结构蛋白的表达程度，并通过免疫组织化学染色和荧光染色观察VEGFR-2和GFAP在脑组织的分布形态和表达情况。进一步通过免疫组化和WB实验验证各组大鼠脑组织大麻素Ⅱ型受体(Cannabinoid receptor type 2，CB2)的分布和表达情况，检测脑组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferatoractivatedreceptor-γ，PPARγ)和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表达情况，以阐明BCP-LP在EBI中的作用机制。
结果：
1、采用乙醇注入-超声分散法成功制备了BCP-LP，其包封率约为81%。透射电镜观察BCP-LP球形颗粒，激光粒度仪测得其平均粒径为189.3±3.8nm，平均ζ电位为-13.9±0.3mV。体外释放行为考察发现BCP可从脂质体中释放出来，并且与物理混合物相比有一定缓释作用。体内实验发现与BCP-OLOIVE相比，BCP-LP可提高BCP在血浆中的药物浓度。
2、各组SAH模型大鼠均表现出严重的神经功能缺陷，在建模后24h以后，BCP-LP干预组大鼠逐渐表现出更好的神经修复能力，在术后72h，BCP-LP的干预使SAH大鼠的行为能力和平衡力几乎恢复至正常水平，与SAH组相比表现出更好更快的功能恢复。在大鼠SAH术后可见CBF明显受损，直至术后48h以后，BCP-LP组大鼠与SAH组大鼠相比明显地改善了SAH大鼠的CBF。SAH后72h检测到大鼠显著的BBB破坏和脑水肿，而在BCP-LP干预组大鼠表现出更少的EB渗出率，提示BCP-LP可促进BBB的修复减轻脑水肿。
3、紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的表达在SAH后72h明显减少，BCP-LP治疗组大鼠脑组织紧密连接蛋白的表达明显高于SAH组大鼠；采用TUNEL染色检测证实SAH大鼠海马神经细胞的凋亡发生明显，WB检测发现凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved-caspase3的表达有所增加，BCP-LP的治疗促进了Bcl-2的表达，抑制了Bax的表达和Caspase3的活化。
4、在SAH术后可见GFAP和VEGFR-2的表达明显增加，胶质细胞和皮层微血管的过度增生，而层粘连蛋白的丢失增加。BCP-LP的干预抑制了GFAP和VEGFR-2的过度表达，同时促进了LN-α的表达增加。CB2在大鼠脑组织中主要在细胞膜和胞浆中表达，SAH后CB2的表达代偿性增加，BCP-LP的干预能够显著增加CB2的表达水平。与此同时，大鼠SAH后PPARγ和MMP-9的表达均增加，而随着BCP-LP的干预上调CB2表达后，PPARγ的表达随之上调，并明显降低MMP-9的表达量。
结论：
1、实验成功制备BCP-LP，并且BCP-LP的体内应用可提高BCP的生物利用度；
2、BCP-LP可通过修复BBB破坏维持其完整性，减轻脑水肿，进而改善CBF，减轻SAH后的神经功能障碍，从而改善EBI发挥神经保护作用；
3、BCP-LP减轻EBI的作用可能是通过调控CB2/PPARγ/MMP-9分子通路，减少细胞凋亡，保护紧密连接蛋白，修复NVU损伤实现的。