二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide,DMF）是一种低毒类有机溶剂,作为一种重要的化工原料广泛应用于有机合成、染料、石油提炼、合成纤维、人造革、医药工业和其它行业。DMF的应用范围不断扩大,国内外需求不断增长,涉及到DMF生产和使用的人群也不断增加,DMF中毒事件也时有发生,给接触DMF作业人群带来职业健康安全隐患,因此预防和控制此类职业危害显得尤为重要。有关DMF是否具有致癌性一直没有统一的定论,尽管有个别流行病学调查报道认为DMF具有致癌性,长期接触DMF可引起遗传物质的损伤,且损伤程度随着接触年限的增加有加重的趋势,动物实验也有类似报道。但是鉴于流行病学调查多以横断面或病例对照研究为主,暴露剂量难以精确估量,无法控制其它混杂因素,存在回忆偏倚、样本量过小等原因,因此所得出结论的可信度值得进一步验证;动物实验由于物种和个体差异性,反应敏感性不同,重复性较差等原因,也使动物实验结果难以得到公认,争议较大。世界卫生组织在1999年评定DMF致癌性为第三类:暂未确定遗传毒性的致癌物。DMF致癌性尚不确定,而肿瘤的形成往往源于细胞遗传物质结构和功能的改变,DNA损伤是肿瘤产生的重要起始信号,有必要对其遗传毒性作进一步的研究。近年来,γH2AX（gamma-H2AX,即磷酸化的H2AX）与DSBs（DNAdouble-strand breaks的简称）的关系引起了许多研究者的关注。DNA双链断裂发生后,组蛋白H2A家族成员中的H2AX成员139位丝氨酸残基迅速磷酸化,形成磷酸化的H2AX即γH2AX,在断裂位点募集损伤修复相关蛋白簇集形成焦点,这一过程可在几分钟之内发生。γH2AX焦点的形成可以在荧光显微镜下清楚可辨。随后,γH2AX在DNA双链断裂的损伤修复过程中发挥作用。由于研究证明γH2AX焦点形成的数量与外界刺激造成的DSBs数量上呈一一对应关系,并且γH2AX焦点的形成与消失这一过程与DSBs的形成与修复有一定的相关性,被认为是一种可灵敏地检测DSBs的有效指标。目前γH2AX已被用来检测多种化合物、病毒、甚至热休克诱导的DSBs的形成。研究表明,根据DNA受损程度的不同,有不同的受损结局。严重的DNA损伤往往导致细胞凋亡,而轻微的DNA损伤,细胞启动修复系统修复损伤的DNA,若未能及时修复则可导致致癌性的突变结局。DNA损伤是导致细胞凋亡的一个诱因。细胞凋亡是细胞在各种不利因素影响下通过激活半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶（cysteinylaspartate specific proteinase,简称Caspase）的级联反应诱发的细胞死亡。Caspase是引起细胞凋亡的关键酶,Caspase一旦被信号途径激活,通过级联放大效应,能将细胞内的蛋白质降解,使细胞不可逆地走向死亡。Caspase家族中目前研究较多的是Caspase-3,处于细胞凋亡途径的核心位置,因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶。本研究以正常成人肝细胞（HL-7702）为研究对象。研究目的1.以γH2AX免疫荧光法焦点形成实验探讨不同剂量和不同时间DMF染毒致正常成人肝细胞（HL-7702）DNA损伤的剂量-效应关系和时间-效应关系。2.以Western blotting实验探讨同一剂量不同时间DMF染毒对正常人肝细胞（HL-7702）Caspase-3表达的影响。研究方法1.γH2AX免疫荧光法焦点形成实验将细胞活度为95%以上、密度为1×10⁶个/ml的HL-7702型单细胞悬液均匀接种于6孔板内盖玻片上,培养24h细胞贴壁后,分别以终浓度为1.56、6.25、25、100 mmol/L的DMF染毒。阳性对照组加入等体积终浓度为100μmol/L的H₂O₂,其他处理同染毒组;阴性对照组加等体积的灭菌PBS缓冲液,其他处理同染毒组。每块6孔板染毒后继续培养0.5、3、6、12、24 h后,同一时间终止培养。细胞经固定、破膜、封闭、鼠源抗γH2AX单克隆抗体为一抗和FITC标记的山羊抗鼠抗体为二抗进行孵育、DAPI染核、封片后在荧光显微镜下进行观察。对于每个样品,荧光显微镜下随机选取100个细胞,按照0、1-10、11-20、＞20四个区间分段统计含不同γH2AX焦点数的细胞核百分含量,以此作为评价DNA损伤效应的指标。2.Western blotting实验将处于对数增长期的肝细胞接种于250ml大培养瓶中,贴壁培养24h后,DMF终浓度为100mmol/L的DMF处理,染毒0、3、6、12h后消化离心收集细胞。用Western方法测定同一剂量的DMF染毒不同时间后对正常成人离体肝细胞Caspase-3表达的影响。考虑到每次实验结果的可比性,将目标蛋白条带灰度值与内参条带灰度值相比,活化的Caspase-3以两亚基条带的灰度值之和计算;再将12 h染毒组的比值设为1,其他染毒时间组灰度值比值与12 h染毒组相比。实验重复3次。实验结果1.DMF诱导人肝细胞DNA的损伤效应DMF不同剂量组与PBS阴性对照组比较,差异均有统计学意义,并随着剂量的增加,焦点数多的细胞核比例逐步增加,具有剂量-效应关系;3h染毒组与0.5h染毒组比较,肝细胞核内γH2AX焦点数及含多个γH2AX焦点（＞10个）的细胞百分含量无统计学差异（P＞0.05）,DMF其他染毒时间组与0.5 h染毒组比较,随着染毒时间的增加,相同指标有减少趋势。2.DMF对人肝细胞Caspase-3激活的影响100mmol/L的DMF染毒不同时间后,长染毒时间组（6h、2h）的procaspase-3条带较其他各组减弱,出现新的Caspase-3亚基条带,提示Caspase-3被切割活化。procaspase-3灰度值比值比各组之间比较,差别无统计学意义（F=1.172,P＞0.05）,随着染毒时间的增加,灰度值比值比总体有减小趋势;Caspase-3亚基灰度值比值比各染毒组之间差别有显著统计学差异（F=73.651,P＜0.01）,且随着染毒时间的增加,灰度值比值比逐渐增大,6h、12h染毒时间组和0 h、3 h相比,差别有显著统计学差异（P＜0.01）,显示存在明显的时间效应关系。结论1.γH2AX免疫荧光法研究DMF诱导人肝细胞DNA的损伤效应研究发现,DMF致人肝细胞DNA损伤存在剂量-效应关系,随着染毒剂量的增加,γH2AX焦点形成数随着增多,焦点数多的细胞核比例逐步增加;但随着染毒时间的增加,从3h,6h,12h到24h,肝细胞核内γH2AX焦点数及含多个γH2AX焦点（＞10个）的细胞核比例总体有减少趋势,存在一定的时间效应关系。2.γH2AX焦点检测法能作为早期、敏感的检测遗传毒性物质对细胞DNA损伤作用的良好指标,有望将其应用到临床作为检测人体在放疗或化疗之后的DNA损伤程度的一种方法。3.一定浓度的DMF染毒后Caspase-3酶原被激活剪切成两亚基,随着染毒时间的增加,Caspase-3亚基的激活逐渐增加,存在明显的时间效应关系,而Procaspase-3表达改变的时间效应不明显。