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单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下简称Lm)是一种革兰氏阳性、无芽孢的短杆菌,能通过食用污染的食物,引起人畜共患的李斯特菌病,是威胁人类健康的主要食源性致病菌之一。GlnR是一种全局性转录调控蛋白,参与调控众多氮代谢相关基因,在氮代谢调控过程中具有重要作用。GlnA是谷氨酰胺合成酶,由glnA编码。在2型猪链球菌和沙门氏菌等细菌中,GInA不仅参与谷氨酰胺代谢,还与细菌毒性有关。Lm中也含有GlnR和GlnA编码基因,但它们在细菌致病性和生物被膜形成等中的作用尚无相关文献报道。为深入探究GlnR和GlnA在Lm中的功能,本文进行了以下工作:(一)在本实验室已有的glnR缺失菌株EGDeAgl?nR的基础上构建了回复菌株EGDe△glnR+pLSV16-glnR。通过比较野生菌株 EGDe、glnR缺失菌株 EGDeAglnR以及回复菌株EGDe△glnR+pLSV16-gllnR在生长、生物被膜形成、毒力方面的差异,初步探究GlnR在Lm中的功能。结果显示:1)显微镜下,以上三株细菌菌体形态无明显差异。但检测生长曲线时发现,无论在营养丰富的BHI(Brain Heart Infusion Broth,简称BHI)培养基中,还是在营养贫瘠的基础培养基MEM(Minimal Essential Medium,简称MEM)中,EGDe△glM的生长速率均低于野生株EGDe,说明GlnR缺失对细菌的生长具有一定的抑制作用。2)EGDe△glnR在24 h和48 h时的生物被膜形成量显著低于EGDe(P≤0.01),说明GlnR缺失导致Lm的生物被膜形成能力下降。3)EGDe△glnR的溶血活性显著低于EGDe(P≤0.01);EGDe和EGDe△glnR对棉铃虫幼虫的半数致死量 LD50分别是 2.69×105 cfti 和 12.6×105 cfu,两者相差 4.7 倍;EGDe△glnR中的相关毒力基因hly以及prfA的转录水平相比EGDe显著降低(P≤0.01)。以上结果暗示GlnR缺失会导致Lm毒力降低。(二)通过比较EGDe和glnA插入缺失菌株EGDe::glnA在生长、生物被膜形成、毒力以及抗酸碱盐胁迫方面的差异,并且结合转录组测序技术探究GlnA在Lm中的功能。结果显示:1)EGDe::glnA在营养贫瘠的MEM中生长速率低于EGDe,且其最大生物量也要明显低于EGDe;2)EGDe::glnA在营养贫瘠的MEM中的生物被膜形成能力显著低于EGDe(P≤0.01);3)EGDe::glnA的溶血活性显著低于EGDe(P≤0.01),EGDe::glnA对棉铃虫幼虫半数致死量LD50比EGDe高3.6倍,表明GlnA缺失会导致Lm毒力显著下降;4)EGDe::glnA在酸碱盐环境中的耐受能力明显低于EGDe;5)对EGDe和EGDe::glnA两株菌进行全基因组转录测序,以EGDe为对照,显著性差异基因的筛选标准为:FDR<0.05&&|log2FC|>=1,结果显示:EGDe::glnA菌株中差异性基因98个,其中下调基因57个,上调基因41个。对差异性基因进行COG聚类分析显示:差异性基因共分属14种功能类别,其中碳氮代谢及能量转运相关基因最多,占差异基因总数的24.14%,并且EGDe::glnA菌株中碳氮代谢相关基因的转录水平大多发生下调,这表明谷氨酰胺合成酶是Lm中碳氮代谢和能量转运的关键酶,该结果也较好地解释了 EGDe::glnA菌株在培养过程中出现的生长缓慢并且其生物量显著性下降的现象;同时生信分析结果显示EGDe::glnA中毒力相关基因如sigB、lmo2672、lmo0051、inlB转录水平下调,与溶血活性实验以及棉铃虫毒性实验中显示的EGDe::glnA的毒力显著低于EGDe的测定结果一致;此外EGDe::glnA中抗胁迫相关基因转录水平下调,这一结果也与生物被膜形成实验中显示的EGDe::glnA的生物被膜形成能力显著下降,并且EGDe::glnA对酸碱盐胁迫的耐受能力明显减弱的结果相符,表明GlnA对Lm的生物被膜形成以及抗胁迫能力有着重要影响。结合上述实验结果,GlnR对Lm的生长、毒力以及生物被膜形成具有重要影响,而GlnA在Lm的生长、毒力、生物被膜形成以及抗酸碱盐胁迫方面也具有重要作用。