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目的军团菌广泛存在于自然界的土壤及水体中,军团菌病是由于吸入被军团菌污染的气溶胶而引起的急性发热性呼吸道疾病,病死率可达15%~30%,而且90%的军团菌病都是由嗜肺军团菌引起。目前军团菌的检测主要采用培养法,但由于营养要求特殊,操作繁琐、耗时长、耗资大,并且阳性率不高。本文研究了军团菌3种不同检测方法,通过对嗜肺军团菌新检测方法的探索,为嗜肺军团菌检测提供重要依据。方法1.采用传统培养法分离培养军团菌。样品处理后接种GVPC平板,37℃培养10天,次日生长不为军团菌,从孵育第三天观察菌落形态,将可疑菌落接种BCYE平板和BCYE-cys平板,37℃培养2d,凡在BCYE平板生长而在BCYE-cys平板不生长的则为军团菌菌落,根据生化反应鉴定其是否为嗜肺军团菌,军团菌诊断血清对嗜肺军团菌进行分型。2.利用PCR法进行检测军团菌的目的基因。根据军团菌的共有基因5S r RNA片段及嗜肺军团菌mip基因片段设计引物,从BCYE平板上挑取菌落混悬于含100μL蒸馏水的EP管中,用热裂解法提取细菌DNA制备模板,PCR扩增目的基因,产物琼脂糖电泳分析,分析分离出的细菌是否为军团菌及是否为嗜肺军团菌。3.利用核酸等温扩增试纸条快速检测技术检测嗜肺军团菌。根据嗜肺军团菌mip基因设计引物探针,与LAMP-p H显色法、LAMP-实时浊度法及荧光定量PCR法相对比,建立嗜肺军团菌LAMP-LFD法,检测反应体系的敏感性与特异性,并应用于环境水样检测。结果1.采用传统培养法,对环境水样中的军团菌进行分离培养。共44个样品分别为34个管网生物膜样品和10个空调冷凝水样品,其中16个样品检出军团菌,阳性率为36.4%;分离出的16株军团菌进行生化反应,生化鉴定结果显示,14株为嗜肺军团菌,占检出军团菌的87.5%;嗜肺军团菌诊断血清分型后显示,14株嗜肺军团菌中12株为LP1,1株为LP2,1株为LP5。2.分离的菌株制备模板分别进行5S r RNA和mip基因的PCR检测。将样本进行军团菌5S r RNA基因片段扩增显示,分离的16株菌均属军团菌;经嗜肺军团菌mip基因扩增显示,其中14株属嗜肺军团菌,与生化鉴定结果相一致。3.本研究以嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,并经过优化确定LAMP-LFD检测反应体系和程序。分别用LAMP-LFD、LAMP-p H变色法、LAMP-实时浊度法对样本进行检测,并以荧光定量PCR检测进行参照。结果显示,LAMP-LFD法的最低检出限为3cfu/μL,且不与其他菌种发生交叉反应,敏感性与特异性都与实时荧光定量PCR结果相一致。应用于环境水样检测嗜肺军团菌,其检测结果也与实时荧光定量PCR检测结果相一致。结论环境水中军团菌的检测,传统方法是分离培养,并结合生化反应鉴定、血清型诊断及PCR进行验证。本研究以嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,并经过优化试验确定LAMP-LFD检测反应体系和程序。用LAMP-LFD、LAMP-p H变色法LAMP-实时浊度法对样本进行检测,并以荧光定量PCR检测进行参照,检测方法的敏感性与特异性。结果显示LAMP-LFD最低检出限为3cfu/μL,且不与其他菌种发生交叉反应,敏感性和特异性都与实时荧光定量PCR结果相符;应用于环境水样检测嗜肺军团菌,其检测结果也与实时荧光定量PCR检测结果相一致。LAMP-LFD操作简单,不需要昂贵仪器,且方法稳定,结果可靠,相比分离培养检测来说,检测时间大大缩短,结果易于观察,有望在基层及现场检测上得到推广与应用。