外科手术、化学药物治疗以及放射治疗被认为是恶性肿瘤的传统治疗主要方法。但是,胆管细胞癌、肝细胞癌是肝胆系统中最常见的两种原发肿瘤,却对化学药物治疗不敏感。为了治疗肝胆系统中最常见的两种原发肿瘤,人们在筛选一些新的抗肿瘤药物。由于抗肿瘤药物的研发是一个耗时长、投入大的工作,因此,人们希望利用现有的药物,研究其新药理学效应,提高胆管细胞癌等的治疗效果。氯喹(Chloroquine,CQ)因其抗疟疾作用而被临床广泛应用。同时氯喹作为经典的自噬抑制剂,通过改变溶酶体的酸性环境阻断自噬体与溶酶体的结合,使得大量的待降解蛋白在细胞中堆积。氯喹对自噬的抑制作用导致了大量损伤蛋白在胞浆中堆积,并诱发了内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS),这种持续的ERS最终将细胞导向死亡。目前为止,已有研究证实氯喹能够诱导胶质瘤细胞发生TRAIL介导的细胞凋亡。我们的实验发现顺铂能够导致Hela细胞的ERS增加和自噬水平增强;并且阻断细胞自噬可以明显增加HeLa细胞对顺铂的化疗敏感性。提示通过研究氯喹抗胆管细胞癌的作用机制,发现新药理学效应,可能会为胆管细胞癌的治疗提供新的靶点。ERS可以通过多种途径诱导细胞自噬,自噬可帮助减轻内质网压力并促使细胞生存,通畅的自噬是减轻ERS引起蛋白堆积的有效途径,二者的协调确保了细胞存活。最近研究发现,自噬不仅仅能够清除错误折叠蛋白,还参与了细胞存活与死亡的调控,发挥着"分子中枢平台"作用。在严重或长期应激条件下还能够触发细胞凋亡,表明两者间有着更加复杂的交叉对话,因此,更好的了解ERS与自噬促生存或促凋亡信号转变的关键节点,通过治疗性干预未折叠蛋白反应(Unfold protein response,UPR)通路的靶分子来调控自噬从而减轻内质网压力,可望为多种疾病的的治疗提供新的有效策略。DNA损伤诱导转录体3(C/EBP-homologous protein,CHOP)被认为是介导ERS诱导的凋亡中最重要的分子之一。一方面,活化的CHOP通过上调Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax发挥促凋亡作用;另一方面,CHOP促进TRAIL受体2(DR5)的转录活化Caspase8依赖的外源途径的细胞凋亡。抑制CHOP的表达能够保护细胞免受ERS损伤诱导的细胞凋亡;同时有实验发现CHOP缺失的小鼠对内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin)更加耐受。这提示我们,CHOP在靶向内质网应激诱导的细胞凋亡中发挥了关键作用。进一步研究证实,在ERS-凋亡信号途径中,存在一种自噬依赖的死亡诱导信号复合体,人们将其称为iDISC(Intracellular death-inducing signaling complex),iDISC与自噬的底物P62密切相关,并通过Caspase8的活化启动细胞凋亡。CHOP可能是联系内质网应激诱导的多条凋亡途径的核心分子。因此,本研究以胆管癌细胞为研究对象,以氯喹为实验工具,通过研究氯喹调控肿瘤细胞中内质网-自噬网络,进一步阐明自噬在胆管癌治疗的作用,为将氯喹老药新用,为胆管癌的治疗提供新的实验依据。方法:1、观察CQ对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响。利用不同浓度的CQ作用于QBC939细胞24h后,通过MTT法检测细胞的存活率;利用50μM CQ作用于QBC939细胞12h和24h,通过Hochest33258染色法检测细胞核的形态,进而反应细胞凋亡情况,进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡比例。2、检测CQ对QBC939细胞凋亡的影响。利用50μM CQ作用于QBC939细胞6h、12h和24h,通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8、PARP、BAX和BAK等蛋白质的表达,进一步通过定量分析确定蛋白质的表达变化。3、检测CQ对自噬的抑制及自噬诱导凋亡途径的调控。通过免疫印迹法对细胞的自噬标志性蛋白LC3和自噬底物P62进行检测,确定CQ对细胞自噬过程的影响。通过免疫印迹、免疫共沉淀和Caspase8活性检测对自噬诱导相关蛋白表达和活性变化进行检测。4、检测CQ对内质网应激相关基因转录和翻译的影响。利用PCR Array基因芯片技术对84个内质网应激相关基因进行筛选,通过免疫印迹法对在转录水平上有显著变化的基因进行验证,通过定量分析确定蛋白质表达量的变化。5、检测CQ对内质网应激所诱导的凋亡相关基因表达的影响。通过qPCR技术对内质网应激核心因子CHOP下游凋亡相关基因的表达进行定量分析,确定这些凋亡基因的表达变化。6、胆管癌患者肿瘤组织内内质网应激、自噬和凋亡相关蛋白表达的检测。利用免疫组织化学方法,对胆管癌患者的肿瘤组织标本进行染色,观察不同患者组织标本中内质网应激和自噬相关蛋白的表达变化。结果:1、CQ作用于QBC939细胞后,细胞存活率随着浓度的增加逐渐降低;细胞在50μM药物作用下,随着时间的延长细胞出现了明显核碎裂浓染的典型凋亡特征;进一步的流式细胞术结果表明细胞随着时间的延长凋亡比例呈现增高的趋势。2、CQ诱导QBC939细胞内凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8、c-PARP表达量显著升高,并且还高表达内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP,同时Bcl2家族促凋亡蛋白BAX和BAK表达量也逐渐的升高,表明CQ可以通过多种途径诱导细胞凋亡。3、CQ的加入导致了细胞内大量P62的堆积,同时LC3的表达水平显著地升高,并且两者升高的趋势均呈现时间依赖性,表明CQ对细胞的自噬具有显著的抑制作用。4、PCR Array基因芯片结果显示:经氯喹处理的QBC939细胞内大部分内质网应激相关基因转录水平发生了变化,其中CHOP、p-ERK、IRE1α、GADD34和GRP78的表达量明显增加,尤其CHOP变化最为显著,升高近10倍,进一步的免疫印迹结果与PCR Array结果一致。这表明CQ能够诱导QBC939细胞发生ERS。5、CQ作用时间的延长,DCR1、DCR2、DCR3、DCR4、DCR5以及TNFR2的基因表达都发生了明显的增加。然而,Trail和Fas两种死亡受体的基因表达没有显著变化。这提示,氯喹可能通过诱导内质网应激关键分子CHOP启动了死亡受体途径依赖的细胞凋亡。6、胆管癌患者肿瘤组织内部高表达GRP78和P62。这表明,肿瘤细胞处在相对较高的内质网应激和自噬水平,并且这种相对较高的稳定状态是一种处在适应性应答和促凋亡之间的临界稳态。结论:1、CQ能诱导胆管癌细胞Bcl2家族促凋亡蛋白BAX和BAK、Caspase3、Caspase8、c-PARP表达量显著升高,同时还高表达内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP。表明抑制自噬时,可能通过多种途径或这些途径之间的交互作用诱导胆管癌细胞凋亡。2、结合PCR-array高通量实验与qPCR结果显示,氯喹可能通过诱导内质网应激关键分子CHOP启动了死亡受体途径依赖的细胞凋亡。CHOP激活除了介导内质网途径凋亡外,还可能间接促进细胞死亡相关受体DCR等的转录,为死亡受体途径凋亡提供分子基础。3、CQ抑制自噬导致P62、LC-II等蛋白的累积,进而加强P62与Caspase8的结合,促进Caspase8的活化,诱导细胞凋亡,我们推测抑制自噬累积的蛋白可能为Caspase8的自活化提供了平台。4、胆管癌患者肿瘤组织内高表达GRP78和P62。这表明胆管癌处在相对较高的内质网应激和自噬水平,临床患者组织标本也提示靶向内质网/自噬途径可能是治疗新的靶标。综上所述,QBC939细胞在CQ的刺激下,出现了明显的自噬抑制,进而导致自噬底物P62及其所携带的错误折叠蛋白的大量堆积,进一步加重内质网应激。CQ调控内质网-自噬网络通过多途径诱发细胞凋亡。来自胆管癌患者标本染色进一步确定了肿瘤细胞内自噬水平和内质网应激水平维持在相对较高的临界稳态,通过外接干预手段打破这种稳态可能导致肿瘤细胞的凋亡。因此,我们通过氯喹对内质网-自噬网络的干预作用促进细胞凋亡,为氯喹应用于抗肿瘤治疗提供了新的切入点。